Foxp3酵母双杂交诱饵表达载体的构建、鉴定和其毒性及自激活效应检测

作者：周丽娜; 吴军; 罗高兴; 贺伟峰; 陈希炜; 柏甘萍; 石东文; 王**; 袁顺宗; 张小容; 胡晓红

来源：第三军医大学学报, 2006, (08): 781-784.

DOI：10.16016/j.1000-5404.2006.08.015

• 基因
• 克隆
• Foxp3
• 酵母双杂交

目的利用酵母双杂交系统,构建人Foxp3酵母双杂交体系中的诱饵载体,并对其进行鉴定。方法获得正常人外周血PBMC,抽提mRNA,通过巢式RTPCR在人外周血PBMC中获得Foxp3基因片断,纯化后连接至pMD18T载体,测序正确,EcoRⅠ、SalⅠ双酶切pMD18TFoxp3和酵母表达载体pGBKT7,回收产物并连接,重组质粒命名为pGBKT7Foxp3,测序正确,用醋酸锂法将重组质粒转化酶母菌AH109,在缺陷性培养基上观察pGBKT7Foxp3在AH109中的表达情况,检测诱饵载体有无毒性作用和自激活功能。结果RTPCR扩增出的DNA片段约1203bp,大小正确,与pMD18T载体连接,测序正确。构建的诱饵载体pGBKT7Foxp3,测序结果表明序列完全正确,融合区域的读码框正确。pGBKT7Foxp3转化酵母感受态AH109,在SD/Trp板上生长良好,在SD/Trp/XαGal平板上长出白色菌落,在SD/His/Trp/XαGal、SD/Ade/Trp/XαGal平板上不能生长,说明AH109[pGBKT7Foxp3]转化成功,对酵母菌株AH109不具有毒性且不具自主激活报告基因的功能。结论成功获得了在酵母细胞中正确表达,并对酵母细胞无毒性且未自主激活报告基因的诱饵表达载体pGBKT7Foxp3,可作为酵母双杂合系统中的“诱饵”,为下一步利用酵母双杂交系统筛选Foxp3相互作用蛋白创造了条件。

• 单位
  第三军医大学西南医院