体外验证SSA报告载体系统对CRISPR/Cas9的切割效率

作者：骈亚亚; 陶凤蓉; 高振祥; 胡继红^*

来源：微生物学免疫学进展, 2021, 49(04): 1-6.

DOI：10.13309/j.cnki.pmi.2021.04.001

• 荧光素酶
• CRISPR/Cas9
• 剪切活性
• 同源臂

目的根据单链退火(single strand annealing, SSA)修复途径原理,构建萤火虫荧光素酶荧光报告基因系统,体外检测SSA报告载体对CRISPR/Cas9的切割效率及gRNA的特异性和剪切活性。方法基于SSA修复DNA双链断裂损伤需要断裂末端包含一段同源重复序列的原理,构建4个萤火虫萤光素酶luciferase基因报告质粒,其中luciferase基因被分成前后两个片段;PCR先扩增luciferase基因319～1 653 bp片段并连接至巨细胞病毒(cytomegalovirus, CMV)启动子表达质粒,随后再分别连接luciferase基因不同长度前段序列,分别为1～579 bp、1～858 bp、1～1 188 bp和1～1 317 bp,每个片段中均含有一段重复序列,并且被终止密码子提前终止为无活性的luciferase基因;设计了261、540、870和900 bp等4个同源臂,将特异性的gRNA连入两段序列中,并加入有活性的Cas9/gRNA,通过检测荧光活性来检测gRNA的特异性和剪切活性。结果成功构建了4个荧光报告质粒pLuc-N1-1～4;用海参荧光素酶作为内参,在293T细胞转染4个荧光报告质粒,在24 h时检测4个质粒的相对荧光强度,均无荧光活性物质产生;在荧光报告质粒中加入特异性的靶点序列,并表达Cas9/gRNA,这些报告基因具有显著荧光强度升高(P<0.000 1),且不受同源臂长度影响。结论成功构建的基于luciferase基因的SSA报告系统,可提供一种简单而快速方法来评估和比较gRNA在CRISPR/Cas9系统引入的indel突变诱导效率,为选择最有效gRNA减少不确定性,大大扩展CRISPR/Cas9介导的模式动物基因工程的实际应用提供可能性。

• 单位
  中国医学科学院; 北京医院