Gcn5基因shRNA的载体构建及其对干细胞分化中组蛋白乙酰化修饰的干扰作用

作者：朱静; 王应雄; 张晓萍; 王金菊; 张小飞; 田杰

来源：中华医学遗传学杂志, 2006, (01): 43-46.

DOI：10.3760/j.issn:1003-9406.2006.01.010

• 乙酰化修饰
• RNA干扰
• 质粒
• 间充质干细胞

目的构建组蛋白乙酰化酶转录辅激活酶Gcn5基因表达的干扰shRNA质粒并初步检测其性质,为研究干细胞诱导分化过程中乙酰化修饰所起的调控作用奠定基础。方法选择7条组蛋白乙酰化修饰关键因子Gcn5基因片段,用带有绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的pGenesil-1作为载体,构建相应7个shRNA质粒。脂质体共转染5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-aza)诱导的大鼠间充质干细胞(mesenchymal stemcells,MSCs),利用乙酰化酶特异性抗体Gcn5(H75)对转染细胞进行免疫化学检测,荧光显微镜图象分析系统,记数细胞,在同视野中记数转染阳性细胞以及干扰的阳性细胞,初步计算出其转染率和干扰效率。结果通过限制性内切酶酶切和DNA序列分析,重组质粒shRNA与设计相吻合;免疫细胞化学检测,发现转染阴性对照HK的细胞显现“饱满核”,乙酰化作用蛋白表达明显;转染shRNA质粒的细胞呈现十分明显表达减弱的“淡染核”或不表达的“空洞核”,转染率和干扰效率分别为93.7%和46.6%。结论构建的shRNA质粒能够达到干扰乙酰化作用的目的,为深入研究乙酰化作用奠定了一定的试验基础。

• 单位
  公共卫生学院; 重庆医科大学