Keratin 5-IRES-eGFP敲入的人胚胎干细胞系的构建

作者：郑雯; 钟亚丹; 王炫; 刘慧婷; 杨斌; 刘军

来源：皮肤性病诊疗学杂志, 2022, 29(04): 299-304.

DOI：10.3969/j.issn.1674-8468.2022.04.003

• 人胚胎干细胞
• CRISPR/Cas9技术
• 角蛋白5
• 基底层角质形成细胞

目的 利用CRISPR/Cas9技术构建一种keratin 5-IRES-eGFP敲入的人胚胎干细胞(hESCs)系，为研究表皮基底角质形成细胞异常的皮肤病提供一种细胞模型。方法 构建针对目的基因keratin 5的sgRNA质粒及打靶Donor质粒，利用CRISPR/Cas9技术完成对keratin 5的定向切割，将IRES-eGFP敲入至keratin 5终止密码子上游，诱导hESCs分化为表达绿色荧光蛋白(GFP)的基底层角质形成细胞。结果 PCR及Sanger测序结果表明IRES-eGFP成功整合至hESCs细胞系的keratin 5终止密码子上游，分化培养后观察细胞形态与角质形成细胞系HaCat形态一致。免疫荧光染色验证hESCs分化获得的ES-KC细胞系稳定表达GFP与keratin 5。结论 成功制备了keratin 5-IRES-eGFP敲入的hESCs细胞系，并诱导hESCs成功分化出带有绿色荧光蛋白标记的基底层角质形成细胞。

• 单位
  南方医科大学皮肤病医院; 佛山市第一人民医院