重组H5N1流感血凝素杆状病毒滴度荧光定量PCR检测方法的建立、验证及应用

作者：吴清胜; 吴相英; 姚春萍; 李媛媛^*

来源：中国生物制品学杂志, 2021, 34(10): 1227-1231.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003452

• 荧光定量PCR法
• 甲型流感H5N1病毒
• 血凝素
• 杆状病毒
• 滴度

目的建立用于重组H5N1流感血凝素杆状病毒滴度检测的荧光定量PCR(qPCR)法,并进行验证及初步应用。方法利用Bac-to-Bac技术构建重组穿梭质粒(rBacmid-H5),以其为模板,梯度PCR扩增H5基因,优化退火温度和引物浓度,建立qPCR检测方法,对该方法的专属性、重复性进行验证,确定线性范围及检测限。应用建立的qPCR方法对H5杆状病毒连续传代4次以及连续培养0～6 d的样品进行检测,并与免疫荧光法进行比较。结果在退火温度55℃,1μL 10 mmol/L引物条件下,建立了qPCR法,该方法检测H5基因,专属性良好;模板浓度在1.15×103～4.25×109copies/μL之间,线性关系良好,R2=0.999;6次重复检测重组H5杆状病毒培养3 d样品,RSD为1.01%,重复性较好。H5病毒连续传代4次,病毒滴度保持相对稳定,培养0～6 d病毒滴度在第3天达到较高值,且检测值均高于免疫荧光法。结论建立了qPCR法进行H5N1流感血凝素重组杆状病毒滴度的特异性检测。