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摘要
为建立传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)灭活快速检验方法,从ISKNV感染CPB细胞系转录谱筛选并经q RT-PCR验证表达量最高的病毒ORF099基因作为快速检测靶基因。以质粒p MDORF099为标准品,采用q PCR方法绘制了CT值与质粒拷贝数的标准曲线,其线性方程为CT=–3.42lgx+39.455,最低检测限为3拷贝/μL,结果显示组间和组内变异系数均小于2%,表明该方法具有较高的灵敏度和较好的重复性。将ISKNV病毒悬液10倍稀释成100103拷贝/m L,分别取1 m L病毒稀释液接种CPB细胞,在第7、9和11天提取细胞总RNA,经基因组DNA去除试剂盒去除残留DNA后采用qRT-PCR方法检测ORF099基因转录本,结果显示在第7天即可从接种1个拷贝病毒的细胞中检测出ISKNV ORF099转录本。将3个浓度梯度(0.05%、0.1%、0.2%)的甲醛灭活ISKNV制备的模拟样品以及实验室制备的3批次ISKNV细胞灭活疫苗样品接种CPB细胞9 d,采用上述快速检验方法进行检测。0.05%、0.1%甲醛灭活模拟样品可检测到ISKNV ORF099基因转录本,其他样品均未检测到。而细胞盲传实验显示,0.1%终浓度甲醛灭活ISKNV接种细胞盲传3代未出现CPE,鱼体安全实验显示接种鱼体后无临床发病症状和实验鱼死亡,表明本研究建立的病毒灭活快速检验方法比细胞盲传法和鱼体安全实验具有更高的灵敏度,与传统检测方法相比具有灵敏度高、耗时短、检测效率高等优点,对提高ISKNV灭活疫苗生产效率具有重要意义。
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