抗体基因点突变、插入和缺失体外检测方法的建立及应用

作者：罗思敏; 叶菱秀^*; 郝茜^*

来源：上海交通大学学报 (医学版), 2022, 42(04): 518-527.

• 激活诱导胞苷脱氨酶
• 点突变
• 插入
• 缺失

目的·建立由激活诱导胞苷脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase,AID）引起的体细胞高频突变过程中，快速检测抗体基因可变（variable,V）、多样（diversity,D）、连接（joining,J）区发生突变（包括点突变、插入和缺失事件）的体外方法。应用该方法检测经2种DNA聚合酶β (polymerase β,Polβ)抑制剂处理的细胞中抗体基因VDJ片段的突变情况。方法·用慢病毒感染法处理CH12F3细胞（即处理组），感染前的CH12F3细胞为对照组。采用蛋白质印迹法（Western blotting）检测2组细胞中AID的表达水平。构建高通量测序文库，应用生物信息学的方法分析处理组和对照组细胞中抗体基因VDJ片段的点突变、插入及缺失频率。采用不同浓度的Polβ抑制剂[扎西他滨（2’,3’-dideoxycytidine,DDC）、5-甲氧基黄铜（5-methoxyflavone,5-MF）]处理CH12F3细胞，并采用台盼蓝拒染法测定该2种抑制剂对细胞增殖的影响。分别以筛选得到的DDC浓度、5-MF浓度处理CH12F3细胞（即实验组），以0.9%NaCl处理的细胞及DMSO处理的细胞依次记为上述实验组的对照组，使用上述已建立的方法进行处理，最终行高通量测序，分析该2种抑制剂对抗体基因VDJ片段中点突变、插入及缺失频率的影响。结果·Western blotting结果显示，和CH12F3细胞对照组相比，CH12F3细胞处理组中AID表达较高；且高通量测序结果显示，该组在抗体基因VDJ片段上存在大量的点突变，且插入和缺失的频率均较高（均P=0.000）。台盼蓝拒染法检测显示，处理CH12F3细胞最适宜的DDC浓度为100μmol/L、5-MF浓度为25μmol/L。最终的高通量测序结果显示，和0.9%NaCl对照组相比，经100μmol/L DDC处理的细胞在抗体基因VDJ片段的点突变频率较低（P=0.000），长度为1 bp的缺失频率亦较低（P=0.009）；和DMSO对照组相比，经25μmol/L 5-MF处理的细胞在抗体基因VDJ片段的点突变频率较低（P=0.000），长度大于1 bp的插入和缺失频率亦有所下降（均P=0.000）。结论·该研究建立的体外检测方法可用于分析AID引起的抗体基因VDJ片段的突变事件。Polβ抑制剂DDC和5-MF对由AID引起的抗体基因VDJ片段的突变事件具有抑制作用。

• 单位
  上海交通大学; 上海市免疫学研究所; 基础医学院