链霉亲和素突变体凝胶柱的制备及生物素修饰蛋白纯化

作者：陈园坤; 伦新新; 李昂; 王鹏举; 张仪婷; 赵晶; 王辉; 阎博^*; 杨安钢^*

来源：细胞与分子免疫学杂志, 2020, 36(04): 304-309.

DOI：10.13423/j.cnki.cjcmi.008998

• 链霉亲和素(SA)突变体
• 生物素修饰蛋白
• 纯化
• 凝胶柱

目的对链霉亲和素(SA)进行定点突变,降低与生物素之间的亲和力,制备SA突变体琼脂糖凝胶柱,并摸索最适洗脱条件,以达到纯化生物素修饰蛋白的目的。方法原核表达SA突变体蛋白使用Ni-NTA纯化树脂进行纯化,将SA突变体蛋白与溴化氰活化琼脂糖凝胶4FF(CNBr-activated Bestarose TM 4FF)偶联制备凝胶柱。生物素修饰蛋白与凝胶柱孵育后,以不同浓度NaOH对生物素修饰蛋白进行洗脱回收,ELISA检测SA突变体蛋白亲和力。通过Western blot法、考马斯亮蓝染色检测纯化效果。结果成功表达并纯化五种SA突变体,并制备凝胶柱。ELISA结果计算得到SA突变体对生物素修饰蛋白的亲和常数相较野生型SA均有所降低。将生物素修饰蛋白与五种凝胶柱相结合,通过Western blot法和考马斯亮蓝染色结果筛选出SA突变体M2凝胶柱可以在10 mmol/L NaOH洗脱条件下,纯化出生物素修饰蛋白,并且SA突变体M2凝胶柱能够对生物素修饰蛋白进行再次纯化。结论成功制备了SA突变体琼脂糖凝胶柱,为生物素修饰蛋白的纯化提供了可行性方案。

• 单位
  新乡医学院; 基础医学院; 中国人民解放军空军军医大学