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摘要
非洲猪瘟病毒(ASFV) B318L是ASFV编码的晚期蛋白，具有香叶基香叶基合成酶活性。为了制备B318L的多克隆抗体并将其初步应用，本研究利用PCR方法从重组质粒p CAGGS-HA-B318L中扩增ASFV B318L基因构建重组表达质粒p GEX-6p-1-B318L，经PCR和测序鉴定正确后转化大肠杆菌BL21 (DE3)经IPTG诱导并克隆至p GEX-6p-1载体中，采用GST亲和层析柱纯化重组蛋白，利用SDS-PAGE检测该蛋白的表达，采用western blot鉴定重组蛋白的纯化效果和反应原性，采用超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度。结果显示，在约60 ku处出现特异性条带，且重组B318L蛋白(rB318L)主要以可溶性形式表达；纯化后在约60 ku处出现了单一特异性条带，经超微量紫外分光光度计测定蛋白浓度为10 mg/m L。将纯化的r B318L 4次免疫小鼠并于3免后一周采血，采用western blot鉴定该多克隆抗体(pAb)，经Protein G亲和层析介质纯化后采用SDS-PAGE进一步鉴定纯化效果，采用间接ELISA检测p Ab的效价。结果显示，制备的小鼠血清(pAb)在60 ku处出现特异性条带，其与原核表达的r B318L发生了反应；该p Ab包含重、轻链且纯度较好，且其效价可达1∶32 000。将不同剂量的p CAGGS-HA-B318L (1μg、2μg、4μg)分别转染HEK293T细胞，24 h后收集细胞，将MOI 1的ASFV HLJ/18株感染猪肺泡巨噬细胞(PAM)，并分别于感染后6 h、12 h、24 h收集细胞。上述细胞均经相应处理后分别采用western blot、间接免疫荧光试验(IFA)(pCAGGS-HA-B318L转染剂量为1μg)检测制备的p Ab的反应原性。Western blot结果显示，HEK293T细胞中出现约35 ku的特异性条带，并随转染质粒浓度的增加B318L蛋白表达量增多；ASFV感染24 h后的PAM在35 ku处出现特异性条带，其余时间点均无该条带。IFA结果显示，过表达B318L蛋白的HEK293T细胞中出现红色荧光；ASFV感染12 h后的PAM中出现红色荧光，24 h后PAM中红色荧光的量增加。将制备的B318L p Ab用于免疫共沉淀(Co-IP)试验检测293T细胞中过表达的B318L、 ASFV感染PAM后内源表达的B318L，以及两种细胞中表达的B38L蛋白与p Ab、Protein A/G Magnetic beads三者结合物的反应性。结果显示，B318L p Ab可以检测到上述细胞中内源过表达和外源表达的B318L蛋白以及结合在beads上的B318L蛋白，均出现约35 ku的特异性条带。上述结果表明，B318L蛋白是ASFV晚期表达的蛋白，且制备并纯化的B318L p Ab反应原性较强，既可以与HEK293T细胞中过表达的B318L蛋白也可以与ASFV感染的PAM中内源表达的B318L蛋白反应，反应原性较强，且可以用于Co-IP试验检测细胞中表达的B318L蛋白，本研究为深入研究ASFV B318L的生物学功能奠定了基础。
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