猪流行性腹泻病毒可视化RT-LAMP检测方法的建立与初步应用

作者：李林岳; 李任峰^*; 袁嘉康; 秦保亮; 庞俊增; 蔡琳琳; 赵晓会; 范国英; 王自良^*

来源：中国预防兽医学报, 2023, 45(08): 814-828.

• 猪流行性腹泻病毒
• RT-LAMP
• 快速检测
• 可视化

为建立猪流行性腹泻病毒(PEDV)可视化反转录-环介导等温扩增(RT-LAMP)检测方法，本研究根据PEDV ORF1a/b基因的保守序列，设计了8组特异性引物，以PEDC cDNA为模板，采用试剂盒推荐的各反应条件经LAMP扩增，根据LAMP反应产物琼脂糖凝胶电泳结果筛选最佳引物组。以筛选的外引物PE2 F3/B3经PCR从PEDV cDNA中扩增ORF1a/b基因，构建重组质粒p PE-ORF1-2并分别经PCR和测序鉴定。结果显示，2号引物组(内引物PE2 FIP/PE2 BIP，外引物PE2 F3/PE2 B3)为最佳引物。PCR和测序鉴定结果表明重组质粒正确构建，经计算其浓度为1.56×1011拷贝/μL，将其稀释1 000倍后作为质粒标准品。为建立检测PEDV的RT-LAMP方法，本研究对该方法的反应时间、反应温度、Mg2+浓度、内、外引物及d NTP浓度进行了优化，结果显示，RT-LAMP反应体系为：60℃反应50 min,Mg2+浓度80 mmol/L，内外引物终浓度分别为32μmol/L和5μmol/L,d NTP浓度10 mmol/L；通过在上述体系中加入甲酚红指示剂，初步建立了可视化RT-LAMP检测方法。特异性试验结果显示，该方法仅能检出PEDV，与猪德尔塔冠状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪传染性胃肠炎病毒均无交叉反应，且阳性管体系颜色由紫红色变为黄色，阴性反应管体系颜色保持紫红色，特异性较强；将重组质粒标准品p PE-ORF1-2 10倍倍比稀释(1.65×100拷贝/μL～1.65×108拷贝/μL)后作为模板，采用本研究建立的可视化RT-LAMP方法进行敏感性试验，结果显示，该方法对p PE-ORF1-2检测限为10拷贝/μL，比以重组质粒p PE-M-GB为模板，以引物PEGBF/PEGBR的PEDV国标RT-PCR方法的敏感性高1个数量级，敏感性较高；重复性试验结果显示，该方法对不同浓度质粒标准品的批内和批间重复性试验的变异系数均小于5%，重复性较好。对53份临床样品检测结果显示，RT-LAMP和RT-PCR对PEDV的检出率分别为32.1%(17/53)和28.3%(15/53)。二者的总符合率为96.2%(51/53)。本研究建立的PEDV RT-LAMP检测方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、操作简便、结果可视化等优点，为PEDV的现场快速检测提供了新的技术支持。

• 单位
  河南科技学院; 新乡医学院三全学院; 动物科技学院