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摘要
目的 探讨circAPLP2对结直肠癌细胞SW480侵袭与转移的调控作用及其分子机制。方法 采用在线数据库Starbase预测circAPLP2与miR-497-5p的结合位点，TargetScan预测miR-497-5p与FGFR1的结合位点。采用qRT-PCR检测LoVo、DLD1、SW480、SW620、Caco-2、HCoEpiC细胞中circAPLP2、miR-497-5p的相对表达水平，Westernblotting检测FGFR1蛋白的相对表达水平。取SW480细胞，设置：(1)siNC组(转染siControl)与sicircAPLP2组(转染sicircAPLP2)，采用qRT-PCR检测circAPLP2、miR-497-5p、FGFR1 mRNA的相对表达水平，Western blotting检测FGFR1蛋白的表达；(2)Vector组(转染对照空载质粒)与circAPLP2组(转染circAPLP2过表达质粒)，采用qRT-PCR检测miR-497-5p、FGFR1mRNA的相对表达水平，Westernblotting检测FGFR1蛋白的相对表达水平；(3)siNC组(转染阴性对照)、sicircAPLP2组(转染sicircAPLP2)与sicircAPLP2+miR-497-5p inhibitor组(转染sicircAPLP2)，采用Transwell实验检测细胞侵袭能力，划痕实验检测细胞迁移能力，Western blotting检测上皮-间质转化(EMT)标志蛋白(E-cadherin、Twist1、N-cadherin、Vimentin)的表达；(4)NC-miRNA组(转染NC-miRNA)、miR-497-5pmimics组(转染miR-497-5pmimics)与NC-inhibitor组(转染NC-inhibitor)、miR-497-5p inhibitor组(转染miR-497-5p inhibitor)，采用qRT-PCR和Western blotting检测FGFR1的表达；(5)pcDNA-Control组(转染pcDNA-Control)与pcDNA-FGFR1组(转染pcDNA-FGFR1)，采用Western blotting检测FGFR1蛋白的相对表达水平；(6)NC-miRNA组(转染阴性对照)、miR-497-5p mimics组(转染miR-497-5p mimics)与miR-497-5pmimics+pcDNA-FGFR1组(共转染miR-497-5pmimics和pcDNA-FGFR1)，采用Transwell实验检测细胞侵袭能力，划痕实验检测细胞迁移能力，Western blotting检测FGFR1和EMT标志蛋白(E-cadherin、Twist1、N-cadherin、Vimentin)的表达。将circAPLP2-W T或circAPLP2-MT报告质粒、FGFR1-W T或FGFR1-MT报告质粒分别与miR-497-5p mimics和circAPLP2共转染SW480细胞48 h，采用荧光素酶报告基因检测系统检测荧光素酶的活性。结果 在线数据库Starbase、TargetScan分析结果显示，circAPLP2与miR-497-5p、miR-497-5p与FGFR1存在结合的位点。与人结肠上皮细胞HCoEpiC比较，结直肠癌细胞LoVo、DLD1、SW480、SW620、Caco-2中circAPLP2相对表达水平明显升高，miR-497-5p相对表达水平明显降低，FGFR1蛋白相对表达水平明显升高(P<0.05)。敲低circ APLP2的表达后，与siNC组比较，sicircAPLP2组侵袭细胞数减少(P<0.001)，划痕愈合率降低(P<0.001),E-cadherin蛋白表达增加，Twist1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达降低(P<0.05)。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-497-5pmimics明显降低了circAPLP2-MT荧光素酶的活性(P<0.001)。miR-497-5p inhibitor可逆转sicircAPLP2对结直肠癌细胞EMT、迁移和侵袭的抑制作用，表现为侵袭细胞数增多(P<0.001)，划痕愈合率升高(P<0.01),E-cadherin表达降低，Twist1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达增加(P<0.05)。双荧光素酶报告实验结果显示，miR-497-5pmimics明显降低了FGFR1-MT荧光素酶的活性(P<0.001)。过表达FGFR1可逆转miR-497-5p过表达对结直肠癌细胞迁移和侵袭的抑制作用，表现为侵袭细胞数增多(P<0.001)，划痕愈合率升高(P<0.01),E-cadherin表达降低，Twist1、N-cadherin、Vimentin蛋白表达增加(P<0.05)。结论 circAPLP2在结直肠癌细胞中表达水平升高，可能通过竞争性结合miR-497-5p促进FGFR1的表达，从而促进结直肠癌细胞的EMT、侵袭和迁移。
