蛇足石杉中赖氨酸脱羧酶基因的克隆表达及功能鉴定

作者：李赛男; 王雯静; 张蓓蓓; 张泽坤; 葛祥宇; 杜宇; 张晓雪; 王娟^*; 史社坡^*

来源：药学学报, 2022, 57(11): 3437-3445.

DOI：10.16438/j.0513-4870.2022-0693

• 蛇足石杉
• 赖氨酸脱羧酶
• 基因克隆
• 石杉碱甲
• 石松生物碱

赖氨酸脱羧酶是石杉碱甲等石松生物碱上游生物合成步骤中催化赖氨酸脱羧生成1,5-戊二胺(尸胺)的关键酶。通过对蛇足石杉(Huperzia serrata)转录组数据的挖掘分析,并结合RT-PCR技术从蛇足石杉中成功克隆出3个赖氨酸脱羧酶基因(HsLDC-L1、HsLDC-L2、HsLDC-L3);利用在线生物信息学分析软件以及DNAMAN、MEGA 7.0等对上述3个基因编码蛋白的性质、二级和三级结构、序列同源性、进化关系等进行了预测分析,发现3个基因编码蛋白均具有植物赖氨酸脱羧酶的保守结构域和活性位点,且与文献报道的产石杉碱甲植物中的赖氨酸脱羧酶具有较近的亲缘关系。进一步尝试利用不同载体在大肠杆菌中对上述3个基因进行表达,结果仅HsLDC-L1与载体pCold TF构建的重组质粒在大肠杆菌E. coli BL21 (DE3)中成功实现可溶性表达,利用Ni2+亲和色谱柱分离纯化得到重组蛋白HsLDC-L1; HsLDC-L1全长由469个氨基酸组成,理论分子质量为50.50 kDa。体外酶活性分析证明HsLDC-L1可以催化赖氨酸脱羧生成尸胺。底物适应性实验发现HsLDC-L1还可以催化鸟氨酸脱羧生成腐胺,但不能催化酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸脱羧。上述结果为进一步研究包括石杉碱甲在内的石松类生物碱的生物合成提供参考,为利用合成生物学策略构建产Δ1-哌啶、石榴碱等石松类生物碱生物合成关键前体的工程菌提供重要的基因元件。

• 单位
  中药现代研究中心; 北京中医药大学