SMAD2和SMAD3在人胚胎干细胞分化过程中的不同调控作用

作者：赵冰楠; 马双羽; 胥春龙^*; 王琼^*

来源：上海交通大学学报 (医学版), 2022, 42(04): 443-454.

• 人胚胎干细胞
• 中内胚层分化
• SMAD2
• SMAD3

目的·探究转化生长因子β (transforming growth factor β, TGFβ)家族下游的关键转录因子SMAD蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein）——SMAD2和SMAD3在人胚胎干细胞（human embryonic stem cell,hESC）体外分化过程中的不同作用。方法·在hESC中，通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测SMAD2和SMAD3在分化过程中的蛋白表达水平。通过CRISPR/Cas9 (clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)技术构建SMAD2敲除（SMAD2 knockout,SMAD2KO）和SMAD3敲除（SMAD3 knockout,SMAD3KO）的细胞系。利用免疫荧光染色检测SMAD蛋白丢失对多能性因子八聚体结合转录因子4 (octamer-binding transcription factor 4,OCT4)和性别决定区Y框蛋白2 (sex determining region Y-box 2,SOX2)，神经外胚层（neuroectoderm,NE）标志因子配对盒因子6 (paired box 6,PAX6)和性别决定区Y框蛋白1 (sex determining region Y-box 1,SOX1)以及中内胚层（mesendoderm,ME）标志因子SOX17的表达影响；同时使用流式细胞术鉴定SMAD2敲除或SMAD3敲除对NE标志因子PAX6以及ME标志因子SOX17、脱中胚蛋白（eomesodermin, EOMES）和C-X-C模体趋化因子受体4 (C-X-C motif chemokine receptor 4,CXCR4)表达的影响。在SMAD2KO和SMAD3KO细胞中分别过表达SMAD2和SMAD3质粒，通过Western blotting检测SMAD2和SMAD3蛋白回补的效果，并利用实时定量PCR (real-time quantitative reverse transcription PCR,qRT-PCR)检测SMAD蛋白回补后对分化过程中的ME关键因子EOMES、叉头框转录因子A2 (forkhead box A2,FOXA2)和GSC同源盒（goosecoid homeobox,GSC）表达的影响。结果·虽然SMAD2和SMAD3的蛋白序列较为相似，但是SMAD2才是hESC中主要表达的蛋白因子。免疫荧光染色结果表明，SMAD2敲除和SMAD3敲除并不会影响hESC多能性因子OCT4和SOX2的表达；同时流式细胞术发现，SMAD蛋白的缺失也不会影响NE标志因子PAX6和SOX1的表达。SMAD3敲除对hESC向ME分化没有显著的影响，而SMAD2敲除严重阻碍了hESC表达ME标志因子SOX17、EOMES和CXCR4。通过qRT-PCR检测显示在SMAD2KO细胞中过表达外源性SMAD2可以有效地恢复ME基因EOMES、FOXA2和GSC的表达，而在SMAD3KO细胞中回补SMAD3对这些ME基因的表达无影响。结论·SMAD2和SMAD3在hESC向ME分化过程中的调控作用不同。SMAD2而非SMAD3是决定hESC表达ME基因的关键。

• 单位
  上海交通大学