登革病毒Ban18HK20株非结构蛋白氨基酸定点突变对病毒增殖及毒力的影响

作者：李明; 房恩岳; 刘晓辉; 李玉华

来源：中国生物制品学杂志, 2023, 36(08): 902-910.

DOI：10.13200/j.cnki.cjb.003971

• 登革病毒
• 定点突变
• 病毒毒力
• 非结构蛋白

目的 探讨非结构蛋白氨基酸突变（NS1-G53D、NS3-E250V）对登革病毒（Dengue virus,DENV）4型Ban18HK20株增殖及毒力的影响。方法 通过与DENV减毒株（PDK53）进行序列比对，确定Ban18HK20株突变位点；采用同源重组技术构建点突变质粒pSPTM-Ban18HK20（G53D）、pSPTM-Ban18HK20（E250V）、pSPTM-Ban18HK20（G53D+E250V），酶切及基因测序鉴定点突变质粒；体外转录获得病毒RNA，电转染Vero细胞拯救获得点突变病毒；通过蚀斑试验、间接免疫荧光试验、病毒全基因组测序、生长动力学试验、CCK-8试验和小鼠神经毒力试验对点突变病毒进行生物学特性鉴定。结果 酶切及测序证实点突变质粒构建正确。免疫荧光试验及病毒测序结果显示病毒拯救成功。点突变病毒比母本病毒蚀斑小。Ban18HK20（G53D）、Ban18HK20（E250V）、Ban18HK20（G53D+E250V）的病毒滴度第4天达峰值，分别为7.67、7.84、7.78 LgPFU/mL；母本病毒第5天达峰值，为7.68 LgPFU/mL。Ban18HK20（G53D）感染的BHK21细胞增殖活力与母本病毒感染的细胞相比显著增高（P=0.003 6）;Ban18HK20（G53D）、Ban18HK20（G53D+E250V）感染的C6/36细胞增殖活力与母本病毒感染的细胞相比显著增高（P 50=8.51 PFU)、Ban18HK20（G53D+E250V）(LD50=0.69 PFU)对3日龄BALB/c乳鼠的神经毒力低于母本病毒(LD50=0.69 PFU)；等量病毒经脑内注射后，点突变病毒Ban18HK20（G53D+E250V）对裸鼠的存活率（60%）高于母本病毒（0）。点突变病毒遗传稳定，在Vero细胞上传至第10代未出现回复突变。结论 非结构蛋白NS1-G53D氨基酸突变减弱了Ban18HK20株对C6/36和BHK21细胞的毒性，双点联合突变可减弱Ban18HK20株在裸鼠体内的神经毒力。本研究为DENV毒力位点研究及疫苗研发奠定了基础。

• 单位
  中国食品药品检定研究院; 长春生物制品研究所; 武汉生物制品研究所有限责任公司