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摘要
目的:借助急性移植物抗宿主病(aGVHD)模型小鼠血清和肠类器官培养技术，建立模拟aGVHD肠道损伤的体外模型并探索类器官水平aGVHD肠道损伤的规律。方法:以20-22 g雌性C57BL/6小鼠和20-22 g雌性BALB/c小鼠分别作为骨髓移植的供鼠和受鼠。受鼠接受致死剂量(8.0 Gy)的γ射线全身照射后的4-6 h内，输注供鼠来源骨髓细胞(1×107/只，n=20)及脾脏有核细胞(5×106/只，n=20)混合液共0.25 ml,建立aGVHD小鼠模型(n=20)。于造模后d 7麻醉aGVHD小鼠，摘取眼球取血，静置离心后收取血清。分离C57小鼠小肠隐窝，在模拟体内肠道干细胞生长增殖的3D培养体系中培养。分别在类器官培养基中加入5%、10%和20%体积比例的aGVHD血清，培养3d,倒置显微镜下观察小肠类器官的形成过程，比较小肠类器官形态。为了进一步评估，收集aGVHD肠道类器官并观察其病理变化。结合HE染色进行肠类器官形态评价；结合Alcian Blue染色，观察aGVHD小肠类器官分泌功能；结合免疫组化技术，分析血清浓度在5%、10%和20%条件下肠类器官中Lgr5+和Clu+肠干细胞分布及变化规律。结果:成功建立了体外模拟aGVHD肠道损伤类器官模型。HE染色结果显示，5%浓度血清组肠道类器官形态明显较10%和20%组完整，随aGVHD血清浓度的升高，肠道类器官形态破坏加重。5%aGVHD血清组小肠类器官数量最多，出芽率最高，病理评分最低；20%aGVHD血清组形态破坏严重，没有出芽，病理评分最高(t=3.668、4.334、5.309,P<0.05)。Alcian blue染色结果显示，20%aGVHD血清组肠道类器官分泌功能较5%组和10%组类器官弱，未见杯状细胞分布及其分泌黏液染色。免疫组化结果表明，5%组的aGVHD血清组的肠类器官中Lgr5+细胞数量较10%aGVHD和20%的aGVHD血清组肠道类器官多，基本未见Clu+细胞，相反，20%aGVHD血清组Lgr5+细胞破坏严重，无法观察，Clu+细胞比例明显升高。结论:aGVHD血清浓度影响体外小肠类器官数量、功能和肠干细胞的数量。血清浓度越高类器官发生损伤风险越大，揭示了aGVHD场景中肠类器官的形成和功能规律，为开展aGVHD肠损伤领域研究提供了新的工具。
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单位解放军总医院; 安徽医科大学; 基础医学院
