pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒的构建及表达产物的纯化与鉴定

作者：李艳敏; 赵商岐; 马西智; 郑佳; 龚巧巧; 丁剑冰; 周晓涛^*

来源：中国病原生物学杂志, 2023, 18(02): 185-196.

DOI：10.13350/j.cjpb.230212

• 细粒棘球蚴
• 重组质粒
• CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)
• 原核表达

目的 构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)原核表达质粒，诱导表达后纯化，获得重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),并对其免疫学特性进行初步鉴定，对其空间结构进行预测。方法 利用DNA重组技术构建重组质粒pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4),将测序正确的质粒转化至E.coli BL21(DE)菌株中，分别采用不同浓度的IPTG在不同诱导时间及温度下诱导表达重组蛋白。取菌液超声破碎，SDS-PAGE分析上清及沉淀中蛋白的表达；通过镍柱亲和层析法纯化蛋白并进行Western blot鉴定。通过生物信息学技术，利用SOPMA、I-TASSER在线数据库预测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)的空间结构。结果 成功构建pET30a-CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组质粒，转化至E.coli BL21(DE)后诱导表达相对分子质量为53×103的重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)。SDS-PAGE分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白在IPTG浓度为0.7 mmol/L,37℃、4 h条件下上清中表达量较高。镍柱层析纯化用20 mmol/L咪唑浓度洗脱的蛋白浓度及纯度较高。Western blot检测重组蛋白CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)能被相应抗体识别，反应条带位于53×103处，与预期相符。生物信息学在线软件分析CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)中各蛋白均能正常折叠，未对优势表位产生影响。结论 利用原核表达成功获得CTLA-4IgV-EgG1Y162-2(4)重组蛋白，并预测出该蛋白的三维结构模型，为细粒棘球蚴重组疫苗的研制提供了重要的实验依据。

• 单位
  基础医学院; 新疆医科大学