大黄鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶的克隆、表达及性质

作者：刘海燕; 杨汝晴; 陈玉磊; 张凌晶; 孙乐常; 刘光明; 曹敏杰^*

来源：水产学报, 2022, 46(07): 1154-1166.

• 大黄鱼
• 肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶
• 基因克隆
• 性质分析
• 圆二色谱
• 同源建模

为探究大黄鱼肌原纤维结合型丝氨酸蛋白酶(MBSP)的性质，实验采用生物信息学方法对大黄鱼MBSP进行基因检索与筛选，通过分子克隆得到大黄鱼MBSP编码区全长cDNA并构建毕赤酵母表达系统得到重组蛋白质(Lc-rMBSP)，分析Lc-rMBSP的酶学性质和二级结构并通过同源建模分析Lc-MBSP的三级结构。结果显示，大黄鱼肌原纤维蛋白中存在MBSP，在55°C下活性最高。大黄鱼基因组中注释为类胰蛋白酶的基因有16条，对这些基因与淡水鱼MBSP进行系统进化树分析和多序列比对，得到同源性较高的基因序列(Lc-MBSP)。Lc-MBSP编码区全长735 bp，共编码244个氨基酸残基。通过毕赤酵母重组表达，分离纯化得到分子量约28 ku的重组蛋白质Lc-rMBSP。表达蛋白的最适温度和pH分别为50°C和8.0。圆二色谱分析表明，温度对Lc-rMBSP二级结构具有较大的影响。Lc-rMBSP在较宽的温度范围内(40～60°C)对MHC具有较高的水解活性。Lc-rMBSP的最适底物为Boc-Leu-Lys-Arg-MCA，并且特异性切割羧基侧的精氨酸残基，而不分解赖氨酸残基。通过同源建模得到Lc-MBSP的三维结构，催化三联体由保守的His-61、Asp-105和Ser-198构成，其底物结合口袋(Ser-192、Gly-215和Ser-225)与类胰蛋白酶的略有不同，这种差异可能是导致Lc-rMBSP与其他胰蛋白酶酶学性质不同的主要原因。本研究可为海水鱼MBSP的研究提供理论参考。

• 单位
  集美大学; 食品与生物工程学院