缺刻缘绿藻CDP-乙醇胺:1,2-二酰甘油乙醇胺磷酸转移酶的基因特征与功能鉴定

作者：焦建璐; 封兵; 毕燕会; 周志刚^*

来源：中国水产科学, 2021, 28(02): 123-135.

• 缺刻缘绿藻
• 乙醇胺磷酸转移酶(EPT)
• 胆碱磷酸转移酶(CPT)
• 磷脂酰乙醇胺(PE)
• 磷脂酰胆碱(PC)
• 膜蛋白

运用反转录PCR与5’-及3’-末端快速扩增技术,从缺刻缘绿藻(Myrmecia incisa Reisigl) H4301中克隆到胞苷二磷酸(CDP)-乙醇胺:二酰基甘油乙醇胺磷酸转移酶(EPT)的基因MiEPT。其cDNA序列全长1914 bp,其中, 5’-非翻译区(UTR)长217 bp, 3’-UTR长533 bp,开放阅读框(ORF)长1164 bp,编码由387个氨基酸组成的蛋白。以缺刻缘绿藻基因组DNA为模板扩增到该基因的DNA序列,长为2853 bp。这两条序列的比对结果显示, MiEPT含有6个内含子,它们将其ORF分隔成7个外显子。经预测, MiEPT为含有8个跨膜区的膜整合蛋白。多序列比结果显示,MiEPT具有CDP-醇磷脂酰转移酶基序。基于不同物种EPT的氨基酸序列所构建的邻接聚类结果表明, MiEPT与已知功能的莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)EPT聚类在一起,由此推测, MiEPT可以催化磷脂酰乙醇胺(PE)的生物合成。为鉴定MiEPT的基因功能,利用表达载体pET-23a实现了在大肠杆菌中重组表达MiEPT的目的。使用超离心技术,获得部分纯化含重组MiEPT的组分。体外酶促反应的产物经薄层层析分析显示,重组表达的MiEPT具有EPT和胆碱磷酸转移酶(CPT)的活性。经棒状薄层色谱的定量分析,可知MiEPT的EPT酶活性是CPT的10.3倍,从而表明, MiEPT在缺刻缘绿藻中能同时参与PE和磷脂酰胆碱的生物合成,但更倾向利用CDP-乙醇胺生产PE。

• 单位
  上海海洋大学