人乳头状瘤病毒16 E6/E7基因稳定表达的永生化角质形成细胞的建立及鉴定

作者：许翠; **; 吴亦琳; 吕群; 李黎明^*; 蒋明军^*

来源：中华皮肤科杂志, 2022, 55(06): 501-507.

• 人乳头瘤病毒16
• 角蛋白细胞
• 慢病毒感染
• 细胞系, 转化
• HPV16 E6/E7

目的构建人乳头状瘤病毒(HPV)16 E6/E7基因稳定表达的人永生化角质形成细胞(KC), 为研究HPV16 E6/E7诱导的细胞永生化及恶性转化机制提供细胞模型。方法两步消化法分离培养原代人包皮角质形成细胞(HFK), 利用慢病毒感染技术对细胞稳定转染HPV16 E6/E7基因, 连续培养30代以上, 筛选出永生化KC, 分为3组:①空白对照组:传代2次的原代HFK;②实验组:传代2次的原代HFK感染LV5-HPV16 E6/E7, 感染细胞记录为A0代, 感染后以传代次数记录(A1、A2……);③阳性对照组:HPV16阳性宫颈癌细胞SiHa。应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、Western印迹实验分别检测空白对照组、实验组、阳性对照组HPV16 E6/E7 mRNA、蛋白及CK14蛋白的表达, CCK-8及Transwell Insert方法检测细胞的增殖及侵袭能力。裸鼠致瘤实验检测实验组A30、阳性对照组SiHa细胞的致瘤能力。结果成功分离原代HFK。LV5-HPV16 E6/E7重组质粒感染原代HFK后, 空白对照组细胞无荧光表达, 连续传代后出现衰老表现, 实验组A30细胞体积、形态较原代HFK无明显变化, 且荧光表达率为100%。与空白对照组相比, 实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E6 mRNA表达水平显著升高(t值分别为7.12、8.07、6.53、5.66;P值分别< 0.001、< 0.001、= 0.001、= 0.005);与空白对照组相比, 实验组A1、A10、A20、A30细胞HPV16 E7 mRNA表达水平也显著升高(t值分别为3.20、4.29、3.75、4.22;P值分别为0.024、0.008、0.013、0.014)。空白对照组未见HPV16 E6/E7蛋白的表达, 而A30及SiHa细胞可见HPV16 E6/E7蛋白的表达。CCK-8实验显示, 实验组A10、A20、A30细胞增殖水平显著高于空白对照组(t值分别为6.49、7.55、9.43;P值分别为0.003、0.002、0.001), 而A1的增殖水平与空白对照组比较, 差异无统计学意义(t = 2.40, P = 0.074)。Transwell Insert侵袭实验显示, A30不能穿过基底膜, SiHa细胞可穿过基底膜被染成蓝色。裸鼠接种A30细胞2个月后无肉眼可见肿瘤, 组织学亦显示无肿瘤形成, 裸鼠接种SiHa细胞后可于皮下形成肿瘤。结论通过采用慢病毒技术转染HPV16 E6/E7基因成功建立人永生化角质形成细胞, 可作为HPV相关研究中的理想细胞模型。

• 单位
  南京大学医学院附属鼓楼医院; 中心实验室; 中国医学科学院北京协和医学院