过表达线粒体融合蛋白2对ARDS肺纤维化的抑制作用及其机制研究

作者：安宁; 周贤; 张晓霞; 杨涛; 许美霞^*

来源：中华危重病急救医学, 2021, 33(07): 861-865.

• 脂多糖
• 线粒体融合蛋白2
• 人胚肺成纤维细胞
• 急性呼吸窘迫综合征
• 肺纤维化

目的探讨过表达线粒体融合蛋白2(Mfn2)对急性呼吸窘迫综合征(ARDS)肺纤维化的抑制作用及其机制。方法离体培养人胚肺成纤维细胞(HELF), 待细胞生长贴壁率达80%以上进行消化传代, 选取状态良好的细胞进行实验。给予5 mg/L脂多糖(LPS)刺激制备ARDS细胞模型(LPS组);并将75 mol/L携带线粒体融合蛋白2腺病毒载体(Adv-Mfn2)转染到HELF中(Adv-Mfn2+LPS组);同时设空白对照组(完全培养基培养)和空载腺病毒载体(Adv-vector)+LPS组作为对照。采用磺基罗丹明B(SRB)法观察各组细胞培养0、12、24、36、48 h的增殖情况;Hoechst 33342染色后, 共聚焦显微镜下观察细胞形态学改变;采用蛋白质免疫印迹试验(Western blotting)检测抗凋亡基因Bcl-2和天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(caspase-3)的蛋白表达;采用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测Bcl-2和caspase-3的基因表达。结果经LPS刺激12～48 h, LPS组细胞增殖率随时间延长而逐渐增加, 而且明显高于空白对照组〔12 h:(10.75±1.51)%比(0.73±1.22)%, 24 h:(20.09±1.71)%比(1.15±1.12)%, 36 h:(20.58±1.55)%比(1.20±1.12)%, 48 h:(21.30±1.51)%比(1.23±1.10)%, 均P<0.01〕;LPS组与Adv-vector+LPS组各时间点细胞增殖率比较差异则均无统计学意义;而Adv-Mfn2+LPS组过表达Mfn2后12、24、36、48 h的细胞增殖率分别为(8.93±1.14)%、(10.52±1.24)%、(10.72±1.30)%、(10.91±1.20)%, 均较LPS组明显降低(均P<0.05)。共聚焦显微镜下显示, 空白对照组细胞核大小不一, 部分细胞核碎裂或核固缩, 形成凋亡小体;LPS组和Adv-vector+LPS组细胞核呈圆形或椭圆形, 大小均匀, 仅出现个别凋亡细胞;而Adv-Mfn2+LPS组过表达Mfn2后, 凋亡细胞较LPS组增多。Western blotting和RT-qPCR检测结果显示, 给予LPS刺激后, LPS组Bcl-2表达较空白对照组明显上调〔Bcl-2蛋白(Bcl-2/GAPDH):0.68±0.01比0.29±0.01, Bcl-2 mRNA(2-ΔΔCT):2.23±0.34比1.00±0.00, 均P<0.01〕, 而caspase-3的表达较空白对照组明显下调〔caspase-3蛋白(caspase-3/GAPDH):0.37±0.02比0.66±0.02, caspase-3 mRNA(2-ΔΔCT):0.31±0.05比1.00±0.00, 均P<0.01〕;与LPS组比较, Adv-Mfn2+LPS组过表达Mfn2蛋白后, Bcl-2表达明显下调〔Bcl-2蛋白(Bcl-2/GAPDH):0.46±0.01比0.68±0.01, Bcl-2 mRNA(2-ΔΔCT):1.45±0.14比2.23±0.34, 均P<0.01〕, caspase-3表达明显上调〔caspase-3蛋白(caspase-3/GAPDH):0.54±0.02比0.37±0.02, caspase-3 mRNA(2-ΔΔCT):0.88±0.10比0.31±0.05, 均P<0.01〕。结论 Mfn2蛋白参与ARDS肺纤维化, 可能与线粒体介导的抑制细胞增殖途径有关。

• 单位
  华中科技大学同济医学院附属普爱医院; 华中科技大学同济医学院附属协和医院