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摘要
【背景】角蛋白酶是一类特异性降解角蛋白的水解酶，在动物饲料、生物肥料、医学、洗涤、制革及环境治理等方面具有重要的应用潜力。【目的】对前期从海洋环境筛选出的一株铜绿假单胞菌Gxun-7的角蛋白酶基因进行克隆、表达，并探究重组酶酶学性质，为角蛋白酶在工业生产中的应用奠定基础。【方法】以铜绿假单胞菌Gxun-7基因组推定的角蛋白酶基因为基础，设计引物克隆获得角蛋白酶基因kp2，构建重组表达质粒pET22b-kp2，并转化到E.coli RosettagamiB （DE3）中进行诱导表达，同时对重组表达菌株的表达条件进行优化。利用镍柱分离纯化重组角蛋白酶并研究其酶学性质。【结果】重组角蛋白酶的分子量约为33 kDa，最适温度和pH值分别为40°C和8.0，在温度30-60°C和pH 6.5-8.0具有较好的稳定性。金属离子Co2+、Cu2+和化学试剂十二烷基磺酸钠（sodium dodecyl sulfonate,SDS）、乙二胺四乙酸（ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA）、苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonyl fluoride,PMSF）对酶活力有抑制作用，而Mg2+、K+、巯基乙醇和二硫苏糖醇（dithiothreitol,DTT）对酶活力有促进作用。重组角蛋白酶具有良好的耐盐性，在12.5%的NaC作用下相对酶活为87.55%。以酪蛋白为底物时，酶的Km值为60.92 mg/mL、Vmax值为9.70 U/mL。【结论】海洋来源铜绿假单胞菌Gxun-7的重组角蛋白酶具有良好的温度、碱、盐稳定性，可应用于工业生产中。
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