反义及小干扰RNA对大鼠肝星状细胞金属蛋白酶组织抑制因子-1表达的抑制作用

作者：丛敏; 王萍; 刘天会; 徐雍; 卢炎; 唐淑珍; 刘晓明; 王宝恩; 贾继东; 尤红

来源：中华肝脏病杂志, 2006, (10): 742-747.

• 金属蛋白酶组织抑制因子-1
• RNA，反义
• 小干扰RNA
• 腺相关病毒
• 肝星状细胞

目的观察以腺相关病毒(AAV)为载体,含有针对大鼠金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1的反义RNA及小干扰RNA(siRNA)的重组AAV(rAAV/ANTI-TIMP-1/neo及rAAV/siRNA-TIMP-1/neo)感染大鼠肝星状细胞系HSC-T6后,TIMP-1表达的受抑制情况。方法经聚合酶链反应(PCR)扩增及酶切后连接,将针对TIMP-1的反义RNA片段及siRNA片段分别构建于AAV载体中并测序鉴定,将其包装成重组病毒后感染大鼠肝星状细胞系HSC- T6,同时设空白对照组。经G418以400μg/ml的浓度筛选30d后,分别应用荧光定量PCR技术及Western blot检测重组病毒感染组及空白对照组HSC-T6 TIMP-1的基因转录及蛋白质表达水平。结果经PCR、酶切及序列测定证实,两种重组AAV载体质粒(pd16-95/ANTI-TIMP-1/neo和pd16-95/siRNA-TIMP—1/neo)克隆成功。将重组质粒包装成病毒感染HSC-T6细胞30 d后,通过荧光定量PCR技术及Western blot分析显示,重组病毒rAAV/siRNA-TIMP- 1/neo组与对照组细胞相比,HSC-T6中的TIMP-1基因的转录被抑制(P＜0．01),且表达水平与对照组相比约下降60%；而rAAV/ANTI-TIMP-1/neo组及空载体组与对照组相比TIMP-1基因的转录及表达水平差异无统计学意义(P＞0．05)。结论通过AAV载体技术重组病毒rAAV/siRNA-TIMP-1/neo可有效地抑制TIMP-1基因的表达,而针对TIMP-1基因全长的重组病毒rAAV/ANTI-TIMP-1/neo对体外培养的HSC-T6细胞TIMP-1基因的转录与表达无明显抑制作用。

• 单位
  首都医科大学附属北京友谊医院