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摘要
为解决抗菌药物不能穿透细胞膜杀伤胞内致病菌的问题，本试验以羊小肠（空肠段）上皮细胞为靶细胞，利用噬菌体展示技术4轮体外生物淘洗，系统地筛选羊小肠上皮细胞的特异性穿透肽，将其作为抗菌肽的载体从而提高抗菌肽的穿透能力。试验采用噬菌体展示技术，经过4轮体外生物淘洗，得到了能与羊小肠上皮细胞结合的多肽；4轮减数筛选后，噬菌体的回收率逐渐提高，特异性的噬菌体克隆得到了有效富集，酶联免疫吸附法（ELISA）测定单克隆噬菌体对羊小肠上皮细胞的亲和力，亲和力≥2的为阳性，筛选阳性噬菌体克隆，提取DNA进行测序，选择高重复率序列，合成细胞穿透肽，同时合成与细胞穿透肽的氨基酸序列及结构相同但组合顺序不同的对照多肽，并与异硫氰酸荧光素（FITC）标签连接。用细胞增殖/毒性检测试剂盒（CCK8）测定细胞穿透肽和对照肽对细胞活力的影响，用荧光显微镜初步观察穿透肽的穿透性，用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测穿透肽在胞内的定位及穿透强度。结果表明：经4轮体外减数筛选噬菌体的回收率增长了226倍，随着第1轮至第4轮筛选轮次增加，与羊小肠上皮细胞结合的噬菌体依次增加；使用ELISA进行检测，结果显示，在随机挑选的30个单克隆噬菌体中，22个检测为阳性克隆（亲合力≥2）；提取阳性克隆噬菌体进行DNA测序分析后，得到2条重复率高的氨基酸序列，VLNSLID命名为SCPP1,HSTTAQF命名为SCPP2；细胞活力结果表明，在浓度低于256μmol/mL时2条细胞穿透肽及其对照多肽的细胞活力仍在90%以上，表明对细胞无毒；荧光显微镜下观察及激光共聚焦结果表明，SCPP1和SCPP2可以特异性穿透羊小肠上皮细胞膜，且SCPP1可以穿透细胞核表现出比SCPP2更强的穿透性，2条对照多肽无穿透能力；流式细胞仪结果显示，SCPP1的胞内平均荧光强度明显高于SCPP2，且呈时间剂量依赖。本试验筛选出了安全可特异性穿透羊小肠上皮细胞的穿透肽（SCPP1），可作为治疗羊肠道胞内菌的抗菌肽的载体。
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单位黑龙江八一农垦大学; 动物科技学院
