猪流行性腹泻病毒RAA-CRISPR/Cas13a检测方法的建立与初步应用

作者：刘华; 殷冬冬; 邵颖; 宋祥军; 王振宇; 潘孝成; 涂健; 何长生; 朱良强^*; 祁克宗^*

来源：畜牧兽医学报, 2023, 54(09): 3991-3997.

• 猪流行性腹泻病毒
• CRISPR/Cas13a
• 重组酶辅助扩增
• N基因
• 检测

将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification, RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关Cas13a蛋白(CRISPR-Cas13a)技术相结合，即RAA-Cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)检测方法。针对PEDV N基因保守区设计RAA特异性引物和CRISPR RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸，并进行CRISPR-Cas13a荧光检测，以RT-qPCR为对照方法，评价该方法的灵敏度、特异性及与RT-qPCR法的一致性。结果表明，该方法最低可检测至101 copies·μL-1,且与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒等常见猪源病原核酸检测无交叉反应。采用RAA-Cas13a检测40份临床样本与RT-qPCR方法阳性符合率为100%,阴性符合率为84.6%,总符合率为95%,Kappa值为0.881。本研究建立的RAA-Cas13a方法灵敏度高、特异性强，为PEDV的临床诊断和流行病学监测提供了可靠的技术手段。

• 单位
  安徽农业大学; 安徽省动物疫病预防与控制中心; 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所