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摘要
目的探讨脂肪间充质干细胞来源的微囊泡(MVs)通过PINK1/parkin信号通路调控软骨细胞线粒体自噬功能缓解骨关节炎进展的作用及其机制。方法试剂盒法提取小鼠脂肪间充质干细胞来源的MVs, 通过NTA粒径分析, 透射电镜镜下鉴定, 蛋白质印迹法(Western blot)法检测标记蛋白表达3种方法对提取获得MVs进行鉴定。将小鼠软骨细胞分为4组:正常组、模型组、MVs治疗组、自噬抑制组。共聚焦显微镜镜下观察活性氧(ROS)染色, JC-1染色检测线粒体膜电位, 红色荧光染色线粒体骨架。此外以实时定量反转录聚合酶链反应(RT-qPCR)方法检测线粒体自噬基因PTEN诱导假定激酶1(PINK1)、帕金蛋白(parkin)、微管相关蛋白轻链3(LC3)的转录水平;Western blot方法检测线粒体自噬标志蛋白PINK1、parkin、LC3的表达, 并使用t检验对统计学结果进行分析。结果模型组ROS荧光强度高于正常组(58.043比36.662, P<0.05), 线粒体ROS生成明显增加。模型组线粒体膜电位极化比例低于正常组(38.27%比93.71%, P<0.05)。模型组线粒体骨架分支长度低于正常组(0.037比23.482, P<0.05), 线粒体骨架断裂增加。模型组PINK1、parkin、LC3B蛋白表达水平低于正常组(PINK1蛋白荧光强度23.978比33.290;parkin蛋白荧光强度23.972比34.353;LC3B蛋白荧光强度5.222比26.137, P<0.05);治疗组ROS荧光强度低于模型组(31.101比58.043, P<0.05), 线粒体ROS生成明显减少。治疗组线粒体膜电位极化比例高于模型组(78.05%比38.27%, P<0.05)。治疗组线粒体骨架分支长度高于模型组(10.491比0.037, P<0.05), 线粒体骨架断裂减少。治疗组PINK1、parkin、LC3B蛋白表达水平高于模型组(PINK1蛋白荧光强度29.197比23.978;parkin蛋白荧光强度31.509比23.972;LC3B蛋白荧光强度21.297比5.222, P<0.05);抑制组ROS荧光强度高于治疗组(69.515比31.101, P<0.05), 线粒体ROS生成明显增加。抑制组线粒体膜电位极化比例低于治疗组(48.73%比78.05%, P<0.05)。抑制组线粒体骨架分支长度低于治疗组(0.074比10.491, P<0.05), 线粒体骨架断裂增加。抑制组PINK1、parkin、LC3B蛋白表达水平低于治疗组(PINK1蛋白荧光强度22.194比29.197;parkin蛋白荧光强度22.038比31.509;LC3B蛋白荧光强度8.980比21.297, P<0.05)。结论脂肪间充质干细胞源性的MVs通过上调PINK1/parkin通路增强线粒体自噬水平, 修复软骨细胞线粒体功能。
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