MicroRNA Let-7b介导甲型流感突变型PB1重组病毒的构建

作者：谭鸣鸣; 沈小玥; 孙文逵; 夏迪; 施毅

来源：医学研究生学报, 2015, 28(07): 683-687.

DOI：10.16571/j.cnki.1008-8199.2015.07.003

• H1N1流感
• miRNA Let-7b
• 基因重组
• 反向遗传学

目的疫苗是预防流感所致疾病的最有效方法,MicroRNA介导的基因沉默机制为构建新型疫苗提供了新思路。文中旨在构建包含装载有miRNA Let-7b结合靶位PB1基因的甲型流感重组病毒。方法比对A/Nanjing/108/2009H1N1的PA、PB1、PB2与let-7b的靶序列选定PB1基因为最优序列后,通过基因突变,插入Let-7b的结合靶位;构建p DP2000重组表达载体,设计p DP-mu-PB1,同时设计对照组p DP-sclb-PB1,并与其余7个质粒共转染MDCK细胞和293T细胞拯救病毒;留取上清接种鸡胚尿囊腔,血凝法检测病毒,TCID50检测病毒滴度;提取病毒RNA,采用RT-PCR扩增病毒c DNA,通过琼脂糖凝胶电泳和核苷酸序列分析鉴定病毒。结果选择PB1片段最优序列(位置83 bp-107 bp),突变片段改变了3个氨基酸,同时有3个碱基不能与Let-7b靶序列配对;酶切鉴定重组质粒构建正确;重组病毒miRT(miRNA target elements)-H1N1和scramble(scbl)-H1N1的血凝效价分别为1∶32和1∶64,病毒滴度为4.68×105TCID50/m L和7.94×104TCID50/m L;测序确认突变病毒包含目的片段。结论构建成功重组病毒株,为进一步的毒力评估实验奠定了基础。

• 单位
  南京大学; 南京军区南京总医院