牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

作者：孙明

来源：中国动物检疫, 2020, 37(10): 99-120.

• 牛巴贝斯虫
• 实时荧光定量PCR
• TaqMan探针

为建立一种灵敏、特异、快速的牛巴贝斯虫检测方法,针对牛巴贝斯虫Rap-1a基因设计引物进行PCR扩增,然后构建重组质粒制作标准品,经过优化反应体系、绘制标准曲线,建立了牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR方法,并进行灵敏度、特异性及稳定性检测,同时利用该方法对37份田间样品进行检测。结果显示:建立的牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR检测方法的标准曲线方程式为y=-3.362×Log(X)+43.32,相关系数R2=0.999,扩增效率为98.4%。该方法的灵敏度为1.0×102 copies/μL,是普通PCR(1.0×104 copies/μL)的100倍。该方法对牛双芽巴贝斯虫、大巴贝斯虫、卵形巴贝斯虫等7种常见的牛梨形虫病检测结果均为阴性,组内和组间重复试验的变异系数均小于2.5%,37份田间样品的阳性检出率为67.5%。结果表明,本试验建立的牛巴贝斯虫TaqMan荧光定量PCR灵敏度高,且特异、稳定,适用于牛巴贝斯虫的诊断,从而为其流行病学调查提供了快速有效的检测方法。