已知位点突变检测中测序引物的规范化设计

作者：谢嘉玲; 申霞; 张蕾; 顾怡瑾; 董磊^*

来源：检验医学与临床, 2019, 16(08): 1023-1026.

• 已知位点突变
• Sanger测序法
• 引物设计

目的作为突变检测的经典方法,第1代测序法(Sanger测序法)可以清晰地读取基因中碱基置换、颠换、缺失和插入等改变,临床已知位点突变引物的设计涉及数据库查询、转录本及位点的核查等环节,过程繁琐。本研究尝试提出一套实用、易操作的已知位点突变引物设计流程。方法随机抽取2018年7月在该院病理科分子病理实验室进行BRAF(V600E)基因检测和FOXL2(C134W)基因检测的甲状腺乳头状癌患者和颗粒细胞瘤患者检测结果各1例。对于LRG网站中已录入基因组、氨基酸、蛋白质3种序列的基因,进入LRG网站下载3种序列,使用Lasergene(DNASTAR,USA)软件通过3种序列的人工比对,确定基因版本号无误,根据突变位点前后400个序列,设计引物;针对LRG网页还未收入3种序列的基因,先人工通过NCBI各个基因库搜索相应的基因组、氨基酸、蛋白质3种序列,并核实3种序列的版本匹配,再根据上述流程设计引物。结果引物设计完成后,经上海生物工程公司订购,使用已知突变结果的FFPE样本作检测,用ABI3500Dx(Thermo Fisher,Scientific,America)测序,观察测序结果,确认所验证基因突变点包含在该序列内。结论目前临床治疗及报告习惯使用氨基酸位置提示突变,而引物设计需要通过核酸位点,因此确认3种序列基因版本号很重要;对于部分已收入LRG网站的基因,一些版本号也会与临床报告中的突变位点有出入,所以即使是有LRG号的基因也要核查基因组、氨基酸、蛋白质3种序列。

• 单位
  上海交通大学医学院附属瑞金医院