不动杆菌磷脂酶D基因的表达、生物信息学及底物选择性分析

作者：吴思怡; 吴林秀; 王凡; 卢梦瑶; 童欣; 李敏; 付新宇; 胡荣康^*

来源：食品工业科技, 2023, 1-12.

DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2023090014

• 不动杆菌
• 磷脂酶D
• 酶学性质
• 蛋白表达
• 磷脂

微生物来源磷脂酶D(Phospholipase D，PLD)因其较高的催化活性和广泛的底物选择谱而成为磷脂合成应用中的热点。本研究以Acinetobacter sp. DUT-2来源的PLD(ADPLD)为研究对象，首先通过生物信息学分析蛋白序列特征，然后构建重组质粒并在大肠杆菌中实现异源表达，进一步纯化酶蛋白并分析ADPLD对不同酰基链长磷脂酰胆碱(PC)的底物选择性，最后通过分子对接和分子模拟探究ADPLD的底物识别机制。通过对ADPLD和其他微生物来源的PLD多序列比对和进化树分析表明，ADPLD与链霉菌来源PLD序列相似度低于30%，且只有一个保守的HKD基序，这表明ADPLD的催化机制可能与传统认知中需要两个HKD基序完成PLD催化过程的反应机制有所不同。ADPLD主要以可溶性蛋白形式表达，仅通过Ni2+亲和层析在50 mmol/L的低浓度咪唑下便能纯化出较为均一的蛋白，以大豆PC为底物时的比活性约为4.09 U/mg。ADPLD对中和短链PC(C6-C14)的活性相对较高，其中ADPLD对8:0/8:0-PC的比活性高于其它酰基链长的PC底物，为13.2 U/mg。当PC的酰基链长从C14增加至C16时，ADPLD对PC的活性明显降低。分子模拟和分子对接结果显示ADPLD的氨基酸残基Thr250、Pro209、Phe293、Ala324、Lys329和Phe453能够分别与PC形成疏水相互作用。Arg383和Gly326能够与PC形成氢键，其中Arg383(N)、Gly326(N)与PC(P)之间的距离< 3 ?。这些结果表明，ADPLD能够与磷脂分子形成一个稳定的酶与底物的中间体。研究结果为ADPLD的分子改造和进一步工业应用奠定了基础。

• 单位
  生命科学学院; 安徽师范大学; 皖南医学院第二附属医院