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摘要
富亮氨酸重复序列神经元蛋白-1基因(leucine rich repeat neuronal protein-1, LRRN1)编码一种Ⅰ型跨膜蛋白，在神经发育与再生进程中发挥重要作用。牛成肌细胞的增殖分化直接影响其肌肉的生长发育，从而影响牛肉的产量。本研究旨在探究LRRN1基因在秦川牛(Bos taurus)不同组织中的表达规律及其对牛成肌细胞增殖分化的影响，以确定其在成肌分化中的主要作用。首先采用q RT-PCR技术检测LRRN1在新生(3日龄)和成年(24月龄)秦川牛不同组织中的表达规律，及其在体外培养的牛骨骼肌成肌细胞不同分化时期的表达特性；利用腺病毒介导的shRNA和pcDNA3.1(+)构建LRRN1基因干扰和过表达载体，转染秦川牛成肌细胞，采用EdU法检测细胞增殖，通过qRT-PCR和Western blot检测增殖标志分子的表达变化；经成肌诱导分化培养基作用后，观察肌管形成表型并检测分化标志分子的表达变化。结果显示，LRRN1在秦川牛各组织中广泛表达，在新生牛和成年牛肾脏和背最长肌中高表达；LRRN1基因表达在成肌分化过程中先升高、后降低，在分化4 d达到峰值，此后逐渐降低，与成肌细胞的体外分化进程具有相同的变化趋势。在成肌细胞中干扰LRRN1基因表达，结果显示，EdU染色的增殖细胞占比显著减少(P<0.05)，增殖标志基因CCNA2(P<0.01)、CCNB1(P<0.05)、PCNA(P<0.01)、CCND2(P<0.05)和CDK1(P<0.05)下调表达，CCND2、CDK1、CCNB1和PCNA蛋白表达量也降低；LRRN1过表达也显著抑制成肌细胞增殖(P<0.05),CCNA2(P<0.05)、CCNB1(P<0.01)、PCNA(P<0.01)和CCNE2(P<0.05)基因表达被抑制，CCNB1、PCNA与CDK1的蛋白表达量也降低。对细胞分化表型进行观察，发现LRRN1干扰抑制肌管形成，抑制分化标志基因MYOG(P<0.01)、MYF5(P<0.01)、MYF6(P<0.01)、MYH3(P<0.01)和CKM(P<0.05)的表达，MYOG、MYF5和MYH3的蛋白表达量也降低；LRRN1过表达则促进肌管形成，MYH3(P<0.01)、MYOD(P<0.05)、MYF5(P<0.05)和MYF6(P<0.05)的基因表达量显著升高，MYOD和MYH3的蛋白表达量也增加。上述结果提示，LRRN1是成肌细胞分化的正向调节因子，但是对成肌细胞增殖的作用尚需更全面和深入的研究。因此，LRRN1对秦川牛肌肉组织的生长发育具有潜在的调控作用，对其深入的功能研究可用于秦川牛的分子育种实践。
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单位动物科技学院; 国家肉牛改良中心; 西北农林科技大学
