基于微滴式数字PCR技术对猪内源逆转录病毒拷贝数的检测方法的建立及应用

作者：卢天宇; 高虹; 杨博超; 于佳楠; 徐亚新; 王若琳; 秦川^*

来源：中国比较医学杂志, 2021, 31(09): 90-97.

• 微滴式数字PCR
• 猪内源逆转录病毒
• 拷贝数
• 绝对定量

目的利用微滴式数字PCR(droplet digital PCR,dd PCR)技术,对猪基因组中猪内源逆转录病毒(porcine endogenous retrovirus,PERV)拷贝数测定方法进行优化,建立PERV拷贝数的检测方法。方法采用Taq Man探针双重dd PCR方法,分别以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)和转铁蛋白受体(transferrin receptor,TFRC)为内参基因,确定对PERV拷贝数检测反应最适合退火温度和反应循环数。另外,通过对浓度梯度稀释的标准品质粒和猪细胞基因组进行检测,以确定最适模板浓度。采用dd PCR和q PCR两种方法测定来自猪源细胞系和巴马小型猪组织中PERV的拷贝数,比较两种检测方法的稳定性。结果基于dd PCR技术检测PERV拷贝数的最适退火温度为59.9℃,最佳反应循环数为50;模板基因组的最适浓度在1.25～7.5 ng;检测同一样品来源基因组中PERV的拷贝数的变异系数在0.44%～8.29%。结论本研究建立了基于dd PCR技术的PERV拷贝数的检测方法并系统的探索了最佳实验条件,与传统的q PCR相比,该方法具有更高的准确性和可重复性,为异种移植研究中供体动物基因组PERV拷贝数的测定提供了灵敏的方法和可靠依据。

• 单位
  北京协和医学院; 国家中医药管理局; 中国医学科学院医学实验动物研究所