本发明公开了一种简易合成泛素探针Ub-Rho110-Gly的方法,首先运用N-S酰基迁移半合成策略制备泛素酰肼Ub(1-75)-NHNH-2,并基于酰肼法将其进一步转化为泛素硫酯Ub(1-75)-Mesna,进而通过直接氨解法获得泛素探针Ub-Rho110-Gly。本发明方法具有制备产率高,合成纯度高(冻干后每1L培养基约可得到Ub(1-75)-NHNH-230~40mg),操作简易,可大量制备的特点。