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摘要
目的为保证DNA条形码序列模板DNA来源的单一性,和最大程度减少凭证标本的形态破坏,建立一种从医学媒介生物微量组织中免提取,直接扩增DNA条形码序列的方法。方法以螨、蚤、蜱单个个体以及小至蝇类后足1/5跗节的组织块为材料,通过优化裂解液浓度、裂解液和缓冲液配比,优化反应体系和反应条件,用KOD FX DNA聚合酶进行DNA条形码序列的直接扩增,反应产物测序,与NCBI基因库中的序列进行比较以验证其是否被污染。结果裂解液优化为NaOH 50 mmol/L;裂解液和缓冲液配比优化为9∶1;反应体积优化为每50μl反应体系中2×KOD FX DNA聚合酶buffer(含Mg2+)25μl、2 mmol/L dNTP 10μl、KOD FX DNA聚合酶(1 U/μl)1μl、正向引物LCO1490(20μmol/L)、反向引物HCO2198(20μmol/L)各1μl;反应条件优化为:95℃3 min;98℃10 s,50℃30 s,68℃1 min,35个循环;68℃7 min。测序结果显示无污染,均为有效序列。结论该方法操作简单而且省去了DNA提取的步骤,节约了时间和费用,适合螨、蚤、蜱单个个体以及小至蝇类后足1/5跗节的组织块DNA条形码序列的直接扩增。
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