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摘要
目的：探讨ATF6对肿瘤细胞免疫原性的影响，初步解析其调控机制。方法：利用CRISPR-Cas9技术敲除骨肉瘤细胞的Atf6，借助CCK-8实验、细胞能量代谢检测、流式细胞术、ATP检测试剂盒、干扰素刺激响应元件（ISRE）-荧光素酶报告细胞、以及实时荧光定量PCR，分别检测野生型（WT）和Atf6~(-/-)癌细胞在PBS或衣霉素（Tm）处理后的活力、线粒体耗氧速率（oxygen consumption rate，OCR）和胞外酸化速率（extracellular acidification rate，ECAR）、磷脂酰丝氨酸外翻和细胞膜通透性、胞内钙离子动员、胞内外ATP浓度、IFNα/β分泌和干扰素刺激基因（ISG）表达水平。在免疫健全小鼠皮下接种WT或Atf6~(-/-)癌细胞，比较二者的成瘤速度、肿瘤组织基因转录图谱、局部抗肿瘤效应T细胞活化有无差异。将WT和Atf6~(-/-)癌细胞同时接种于nu/nu小鼠两侧皮下，或将Atf6~(-/-)癌细胞分别接种于免疫健全和Ifnar~(-/-)小鼠皮下，记录肿瘤生长曲线。分别用Tm预处理的WT和Atf6~(-/-)癌细胞初免（prime）na?ve小鼠，收集引流淋巴结细胞并体外再刺激（boost），分析特异性T细胞活化有无差异。按照不同的效靶比，将NK细胞与染料标记的两种癌细胞共培养，流式检测细胞杀伤情况。结果：PBS或Tm处理后，WT和Atf6~(-/-)骨肉瘤细胞活力和增殖、氧化磷酸化和糖酵解、离子霉素触发的胞内钙离子动员、胞内外ATP和IFNα/β分泌均无显著差异。Tm处理后，Atf6~(-/-)细胞死亡低于WT细胞。在免疫健全小鼠体内，Atf6~(-/-)肿瘤的生长速度明显低于WT肿瘤（P<0.05）。然而，在缺乏T细胞的nu/nu小鼠体内，两种肿瘤生长速度的差异显著缩小。与免疫健全小鼠相比，Ifnar~(-/-)小鼠体内Atf6~(-/-)肿瘤的生长速度略快（P<0.05）。Atf6~(-/-)肿瘤内免疫应答相关基因的表达、效应T细胞的活化均显著高于WT肿瘤（P<0.05）。与WT癌细胞相比，Atf6~(-/-)癌细胞与NK细胞共培养后死亡比例更高（P<0.05）。在Tm刺激后，Atf6~(-/-)癌细胞比WT癌细胞表达更多的Irf3和Irf7，前者在prime-boost实验中可刺激T细胞分泌更多的IFN-γ。结论：阻断ATF6信号通路能显著增强癌细胞的免疫原性，促进免疫监视，阻碍肿瘤进展。
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单位南京医科大学; 苏州系统医学研究所; 中国医学科学院
