CRISPR/Cas9介导人HBB基因突变体在猪成纤维细胞的靶向敲入

作者：张婷婷; 杨漫漫; 魏强; 李燕莉; 李林; 王然; 胡莉花; 姜芳芳; 刘瑜; 赵卫华^*; 李勇^*

来源：中国实验动物学报, 2020, 28(06): 779-787.

DOI：10.3969/j.issn.1005-4847.2020.06.007

• 地中海贫血
• HBB基因突变体
• 同源重组
• 靶向敲入
• 成纤维细胞

目的将人地贫相关基因HBB(h HBB)的高频突变体基因型Condons41/42(-CTTT)靶向敲入猪成纤维细胞,并筛选出基因型阳性的纯合子细胞系。方法 (1)合成人地贫相关基因HBB(h HBB)突变体,并构建猪HBB位点两条同源臂载体。(2)利用infusion技术将h HBB突变体插入两个同源臂之间,构建同源重组终载体。(3)用在线软件http://crispr.mit.edu/设计靶向猪HBB的sgRNA,并在猪PK15细胞中验证其活性。(4)利用电转染法把CRISPR/Cas9、sg RNA和目的载体共同转入巴马猪胎儿成纤维细胞中,筛选单细胞克隆。结果 (1)合成了h HBB突变体,从野生型巴马猪基因组上扩增左同源臂(1.062×103)以及右同源臂(1.024×103),并将三者连接到终载体pGH-LA-hHBB-RA。(2)设计合成了11条靶向猪HBB基因的sg RNA,全部验证活性后最终挑选#2sgRNA和#11sgRNA用于后续实验。(3)通过CRISPR系统共制备出15株有h HBB突变体定点敲入的猪成纤维细胞系,其中6株细胞正常表达h HBB基因。结论本研究所制备的携带人源化HBB基因突变体的猪成纤维细胞,将为创制高度模拟人地贫的模型猪奠定基础。

• 单位
  深圳市华大农业应用研究院; 深圳市第二人民医院; 深圳大学; 深圳华大三生园科技有限公司