脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激抑制Wnt7/β-catenin通路导致血脑屏障损伤的机制研究

作者：董海平; 谢海怡; 马晓晓; **虹^*

来源：上海交通大学学报 (医学版), 2023, 43(07): 829-838.

• 内质网应激
• Wnt7/β-catenin
• 血脑屏障
• 缺血性脑卒中

目的·探讨缺血性脑卒中后脑血管内皮细胞Wnt7/β-catenin信号失活是否导致血脑屏障（blood-brain barrier,BBB完整性破坏，并研究内质网应激爆发是否介导了Wnt7/β-catenin通路的抑制。方法·采用线栓法阻断小鼠大脑中动脉建立大脑中动脉栓塞（middle cerebral artery occlusion,MCAO）模型，脑缺血60 min后拔除线栓。向MCAO模型小鼠腹腔注射内质网应激抑制剂4-苯基丁酸（4-phenylbutyric acid,4-PBA）作为4-PBA+MCAO组。并设置假手术组（Sham组）。MCAO后24 h用伊文思蓝（Evans blue,EB）测定小鼠BBB的通透性，干湿法测定脑组织含水量，免疫荧光测定小鼠脑血管内皮细胞和周细胞黏附性。对人脑微细血管内皮细胞（human brain microvascular endothelial cells,HBMECs）进行氧糖剥夺（oxygen and glucose deprivation,OGD） 4 h，加入4-PBA培养24 h。细胞实验分为空白对照组、OGD组和OGD+4-PBA组。采用CCK-8测定细胞活力，通过检测FITC标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）的通过率来评估细胞通透性；通过ELISA测定HBMECs中血小板衍生生长因子β (platelet-derived growth factor β,PDGF-β)的分泌水平；采用Fluo-3 AM钙离子荧光探针检测细胞的荧光强度并评估细胞内钙离子浓度，通过CM-H2DCFDA荧光探针测量活性氧（reactive oxygen species,ROS）含量以明确细胞内质网应激状态；蛋白质印迹法（Western blotting）检测HBMECs中的连接蛋白[紧密连接蛋白1 (zonula occludens-1,ZO-1)和密封蛋白5 (claudin-5)]、内质网应激蛋白[CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白（CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein,CHOP）、葡萄糖调节蛋白78 (glucose-regulated protein 78,GRP78)、门冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶12 (cysteine-containing aspartate-specific proteases 12,Caspase-12)]、Wnt7和β-连环蛋白（β-catenin）的表达水平。结果·MCAO模型小鼠脑梗死区水含量较假手术组增加，EB渗出量明显增多（均P<0.05），小鼠脑血管内皮细胞和周细胞之间的黏附性下降；腹腔注射4-PBA后MCAO模型小鼠脑水肿程度减轻，BBB的渗透性降低（均P<0.05），脑血管内皮细胞和周细胞之间的黏附性增加。与空白对照组HBMECs比较，在OGD条件下细胞活力下降，通透性增加（均P<0.05）；同时，OGD组HBMECs中连接蛋白ZO-1、claudin-5的表达水平下降，PDGF-β的分泌水平减少，钙离子浓度升高，ROS含量明显上调，内质网应激蛋白CHOP、GRP78、Caspase-12的表达水平增加，Wnt7和β-catenin的表达水平下降（均P<0.05）。而当HBMECs的OGD模型经4-PBA处理后，OGD导致的HBMECs损伤减轻，细胞中连接蛋白的表达水平增加，HBMECs的通透性降低，PDGF-β的分泌水平增加，并且Wnt7/β-catenin信号的活性明显恢复（均P<0.05）。结论·脑卒中后脑血管内皮细胞内质网应激爆发导致Wnt7/β-catenin信号失活引起的内皮细胞损伤，是BBB破坏的关键途经。

• 单位
  上海交通大学医学院附属仁济医院