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摘要
目的:构建土拉弗朗西丝菌Novicida亚种Cpf1蛋白编码基因的原核表达质粒,在大肠杆菌中表达、纯化重组Fn Cpf1蛋白后,制备兔抗Fn Cpf1多克隆抗体。方法:利用PCR技术扩增Fn Cpf1基因,将其克隆到原核表达载体pET-32a(+)中并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导目的蛋白的表达,通过镍离子金属螯合磁珠亲和纯化得到纯度较高的Fn Cpf1蛋白,将纯化蛋白免疫新西兰大白兔制备Fn Cpf1多克隆抗体,并用间接ELISA法检测兔抗血清效价、Western blot鉴定其特异性。结果:扩增得到3 900 bp的目的基因片段,克隆到表达载体pET-32a(+)后,通过双酶切及测序证实pET-32a(+)-Fn Cpf1表达载体构建成功,可诱导表达相对分子质量160 k D的目的蛋白,经SDS-PAGE分析其为可溶性,通过镍离子金属螯合磁珠亲和纯化得到纯度为95%以上的Fn Cpf1蛋白,制备多克隆抗体并检测兔抗Fn Cpf1抗血清ELISA效价达1:512 000,Western blot结果显示制备的抗体可较好地与Fn Cpf1蛋白特异性结合。结论:在原核系统中成功表达了Fn Cpf1重组蛋白,并用纯化后的蛋白制备出兔抗Fn Cpf1抗体,效价及特异性均良好,为进一步探讨Cpf1蛋白的生物学特性打下实验基础。
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单位重庆市中医院; 重庆医科大学
