SDSL-EPR技术检测LC3B蛋白功能结构域中特定位点的运动特性

作者：赵曦; 董国福; 马蕾; 郭俊旺; 吴可^*

来源：军事医学, 2019, 43(09): 664-668.

• SDSL-EPR
• 自噬相关蛋白质类
• LC3B
• 旋转相关时间
• 运动性

目的用定点自旋标记-电子顺磁共振(SDSL-EPR)技术检测自噬相关蛋白LC3B功能结构域上特定氨基酸位点的运动特性。方法采用序列重叠延伸PCR(SOE-PCR)法对LC3B蛋白NHD结构域α1螺旋Q9位点、ULD结构域α3螺旋N59位点以及口袋结构内部β1折叠135位点引入半胱氨酸(cysteamine,Cys)突变,表达纯化获得LC3B突变体蛋白;甲烷硫代磺酸(2,2,5,5-tetramethyl-1-oxyl-3-methyl methanethiosulfonate,MTSL)自旋标记后进行电子顺磁共振(EPR)检测,通过计算EPR波谱旋转相关时间τc,分析不同氨基酸位点的运动特性。结果构建了LC3B突变体基因的原核表达载体pET-22b-LC3B,实现了蛋白的可溶性高效表达;Q9C和N59C位点EPR波谱呈现双成分叠加谱,Q9C位点不同运动成分的τc值分别为1和3.8 ns,N59C位点为1和3.4 ns;I35C位点为三成分叠加谱,其τc值分别为0.7、2.9和8.1 ns。结论存在于特定氨基酸位点的运动性差别,预示着溶液状态下LC3B蛋白各功能结构域的同一氨基酸位点处可能存在不同的构象特征。