慢病毒介导稳定表达Cas9蛋白的鸡成纤维细胞系构建及其活性验证

作者：李晓娇; 朱新宇; 邹娴; 严霞; 何燕华; 罗成龙

来源：广东农业科学, 2023, 50(02): 125-135+2.

DOI：10.16768/j.issn.1004-874X.2023.02.014

• 稳定表达
• 慢病毒
• CRISPR/Cas9
• SSA修复
• 载体构建
• DF-1

【目的】筛选稳定表达Cas9蛋白的鸡成纤维细胞系（DF-1），并基于单链退火修复机制（Single Strand Annealing, SSA）的报告载体系统，检测DF-1细胞系中的Cas9核酸酶活性。【方法】将携带Cas9蛋白的慢病毒载体质粒与辅助质粒一起转染293T细胞包装慢病毒，收集慢病毒Cas9上清液感染DF-1细胞，经抗生素筛选得到稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞，分别用PCR和Western blot验证阳性DF-1细胞表达Cas9蛋白的情况；选择鸡卵清白蛋白（OVA）基因的sgRNA序列，将sgRNA退火产物克隆至pYP152构建sgRNA表达载体，并在sgRNA靶位点两端设计引物扩增OVA基因靶片段，将靶片段克隆至报告载体pCMV-SSA-mCherry-HindⅢ，以破坏mCherry蛋白的表达，之后再将sgRNA表达载体与SSA报告载体共同转染稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞，最后在荧光显微镜下分析不同稳转株对mCherry蛋白表达的修复情况。【结果】经抗生素筛选得到27株稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系，采用PCR扩增稳转细胞基因组，结果显示这些细胞具有Cas9蛋白基因序列，Western blots试验结果显示上述稳转细胞株均表达Cas9蛋白；sgRNA表达载体与mCherry-SSA报告载体共转后，通过荧光显微镜观察发现筛选到的稳转细胞株均可恢复报告载体中mCherry蛋白的表达。【结论】成功构建了具有切割活性的稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系，可为后续在稳定表达Cas9蛋白的DF-1细胞系上开展鸡相关功能基因研究提供基础材料。