利用Cas9/sgRNA体系提高猪胎儿成纤维细胞基因组编辑效率

作者：姜爱文; 郭鸿运; 吴望军; 刘红林^*

来源：南京农业大学学报, 2023, 46(03): 545-554.

• CRISPR/Cas9
• 基因编辑
• 猪
• ROSA26

[目的]本文旨在利用Cas9/sgRNA体系，提高猪胎儿成纤维细胞的基因组编辑效率。[方法]针对猪ROSA26位点的启动子区(包含第一外显子区)设计2条sgRNA,将其构建在PX459-cas9-puro质粒上，以获得PX459-cas9-sgRNA质粒。将sgRNA靶序列连同原间隔序列(protospacer-adjacent motif, PAM)构建在RGS-CR质粒上，以获得RGS-sgRNA质粒。使用PX459-cas9-sgRNA质粒与RGS-sgRNA质粒系统共转染，筛选打靶效率较高的一条sgRNA,并使用该sgRNA对猪胎儿成纤维细胞(PEF)进行后续基因打靶试验。分别使用PX459-cas9-sgRNA质粒和Cas9/sgRNA 2种方法对PEF的靶位点进行基因敲除，将转染后的细胞提取基因组DNA,以桑格尔测序检测打靶效率。[结果]成功构建了打靶猪ROSA26靶序列的PX459-cas9-sgRNA质粒和含PAM序列的RGS-sgRNA,质粒测序结果显示序列插入正确；RGS-sgRNA筛选结果表明，sgRNA2的打靶效率极显著高于sgRNA1(P<0.01),且sgRNA2无脱靶效应，因此后续使用PX459-cas9-sgRNA2和Cas9/sgRNA2在PEF中进行基因打靶试验，并比较两者的基因打靶效率。在猪胎儿成纤维中，PX459-cas9-sgRNA2质粒的打靶效率为15.67%,Cas9/sgRNA2体系的打靶效率为33.33%。[结论]Cas9/sgRNA体系较PX459-cas9-sgRNA质粒打靶效率提高了约1倍，这对提高猪体细胞的基因编辑效率和促进基因编辑在猪上的应用有重要意义。

• 单位
  动物科技学院; 南京农业大学