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摘要
目的探讨7-去氧水仙环素调节肝癌的生长及分子作用机制。方法采用MTT和平板克隆形成实验检测7-去氧水仙环素作用对细胞活力及单细胞增殖能力的影响;Western印迹分析和流式细胞技术检测检测7-去氧水仙环素对肝癌细胞凋亡的影响;免疫荧光染色、透射电子显微镜观察及自噬双标腺病毒染色等检测7-去氧水仙环素对细胞自噬的影响;Western印迹法及免疫荧光染色检测对EMT现象的影响。应用自噬抑制剂(Bafilomycin A1)或采用小干扰RNA(si RNA)抑制自噬探究对凋亡和EMT的影响;应用细胞热转变分析实验(CETSA)和药物亲和力反应靶标稳定性测定(DARTS)实验分析7-去氧水仙环素与蛋白激酶B(Akt)之间的结合关系,采用分子对接模拟7-去氧水仙环素与Akt之间的作用位点,利用Western印迹实验对其进行验证;将两种肝癌细胞系HepG2和Hu H-7的Akt进行过表达,应用Western印迹和免疫荧光染色实验分析7-去氧水仙环素对肝癌细胞的凋亡、自噬和EMT的影响;建立原位肝癌小鼠模型,采用HE染色及免疫组化实验检测7-去氧水仙环素在体内调节的抗肿瘤作用;TCGA数据库进一步评估Ak磷酸化水平与肿瘤患者生存周期之间的关系,基因集数据库进一步探讨Akt与凋亡、自噬和EMT相关信号通路的关系。结果 7-去氧水仙环素显著下调肝癌细胞生存活力,降低单细胞增殖能力;显著改变凋亡相关蛋白PARP、活化胱天蛋白酶3、Bcl-2和Bax,自噬相关蛋白P62和LC3B,EMT相关蛋白E-cad、N-cad和Vim的表达水平。抑制自噬,在7-去氧水仙环素作用下,细胞活力进一步下降,单细胞增殖能力进一步降低,细胞凋亡进一步增加,EMT相关蛋白E-cad和Vim进一步改变。7-去氧水仙环素可减缓链金霉素或温度对Akt蛋白的降解速度,7-去氧水仙环素可以直接与Akt的C-末端结构域结合,并可以显著抑制Akt的磷酸化(S473位点)活性;过表达Akt后,7-去氧水仙环素抑制的细胞活力有一定程度的恢复,凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白及EMT相关蛋白均有一定程度的逆转。7-去氧水仙环素治疗后,小鼠肝脏上的肿瘤数量和大小均有显著减少,对肝癌的肺转移也有一定程度的抑制,凋亡相关蛋白PARP-Ⅱ表达增加,EMT相关蛋白Vim表达增加,与氯喹(CQ)共同作用后,进一步抑制原位肝癌和肝癌的肺转移,TCGA数据库分析结果表明,p-Akt表达水平与多种癌种患者生存周期密切相关;GSEA结果表明Akt与凋亡、自噬和EMT相关信号通路关系密切。结论 7-去氧水仙环素通过促进肝癌细胞凋亡、诱导细胞自噬并抑制其EMT进程,进而发挥抗肝癌作用。
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