自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞凋亡中的作用

作者：杨姗; 李冠胜; 陈雪梅

来源：重庆医科大学学报, 2018, 43(03): 431-438.

DOI：10.13406/j.cnki.cyxb.001587

• 低氧
• 人肾小管上皮细胞
• 自噬
• 凋亡

目的:探讨自噬在低氧诱导人肾小管上皮细胞株(HK-2)凋亡中的作用。方法:培养HK-2细胞,根据培养环境氧浓度不同分为对照组(21%O2)和低氧组(1%O2);根据低氧培养时间不同,低氧处理细胞进一步分为:低氧6 h亚组、低氧12 h亚组、低氧18 h亚组和低氧24 h亚组。Western blot检测HK-2细胞自噬相关蛋白Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和凋亡相关蛋白活化的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶(cleaved-caspase3)表达水平,流式细胞仪检测HK-2细胞凋亡情况;采用低氧诱导稳定表达GFP-LC3的HK-2细胞18 h,在荧光显微镜下观察GFP-LC3自噬小体的变化;进一步采用低氧联合自噬诱导剂雷帕霉素(rapamycin,RP)或自噬抑制剂巴弗洛霉素A1(bafilomycin A1,BAf A1)处理HK-2细胞,细胞分为常氧对照组、常氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组、低氧对照组、低氧+雷帕霉素/或巴弗洛霉素组。Western blot检测Beclin1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、P62和cleaved-caspase3表达水平,流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果:与对照组(0.161±0.043)相比较,低氧12 h[(0.315±0.060),P=0.019]、18 h[(0.586±0.063),P=0.000]、24 h[(0.698±0.085),P=0.000]亚组HK-2细胞cleaved-caspase3蛋白表达明显增多;低氧12 h、18 h、24 h亚组HK-2细胞凋亡率分别为(23.633±5.346)%、(25.200±4.782)%、(38.567±8.046)%,较对照组(11.800±3.966)%明显增多(P=0.036,P=0.021,P=0.000)。同时,低氧18 h、24 h亚组HK-2细胞表达Beclin1蛋白[(0.557±0.071),(0.897±0.074)[较对照组(0.249±0.040)明显上调(P=0.001,P=0.000);低氧6 h、12 h、18 h、24 h亚组细胞表达LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白[(1.795±0.143),(2.873±0.078),(3.029±0.089),(3.735±0.059)]较对照组(1.322±0.191)明显上调(P=0.036,P=0.000,P=0.000,P=0.000);细胞表达自噬底物P62蛋白[(0.776±0.061),(0.602±0.119),(0.419±0.117),(0.384±0.068)]较对照组(0.957±0.035)明显下调(P=0.028,P=0.001,P=0.000,P=0.000);低氧组细胞GFP-LC3斑点计数相对值为(40.667±6.028),较对照组(18.667±5.508)明显增加(P=0.010)。雷帕霉素增加自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡(26.433±3.402)及cleaved-caspase3蛋白表达(0.265±0.066)较低氧对照组[(36.133±5.856),(0.358±0.060)]明显减少(P=0.012,P=0.000);巴弗洛霉素A1抑制自噬后,低氧诱导的HK-2细胞凋亡增多(49.233±3.412)及cleaved-caspase3蛋白表达(1.242±0.110)较低氧对照组[(25.933±3.650),(0.659±0.060)]明显增加(P=0.000,P=0.000)。结论:自噬在低氧诱导的HK-2细胞凋亡中起保护作用。

• 单位
  重庆医科大学附属第一医院