MHC五聚体方法检测基因疫苗体外诱导的抗原特异性细胞毒T淋巴细胞

作者：李绵洋; 朱平; 王成彬; 王红霞; 潘玉玲; 丛玉隆; 达万明

来源：中华检验医学杂志, 2010, (7): 686-690.

DOI：10.3760/cma.j.issn.1009-9158.2010.07.020

• 疫苗
• DNA
• T淋巴细胞
• 细胞毒性
• 组织相容性抗原I类

目的 探讨MHC五聚体方法检测在体外用抗B细胞淋巴瘤基因疫苗(简称基因疫苗)刺激PBMC生成抗原特异性CTL的效率.方法 用于细胞培养的4份血液标本来自2例B淋巴细胞肿瘤患者(1例为滤泡性淋巴瘤患者,另1例为毛细胞白血病患者)和2名健康对照者.分别检测上述标本中PBMC受基因疫苗刺激后CTL生成情况.PBMC贴壁培养获得DC前体,在重组细胞因子GM-CSF和IL4的支持下诱导培养DC,采用基因枪方法将基因疫苗质粒导入DC,RT-PCB方法检测转染后细胞IgHV1-GM-CSF mRNA的转录,ELISA方法检测细胞因子GM-CSF的表达,并验证转染是否获得有效表达.转染后的DC再与从PBMC中获得的淋巴细胞共培养,诱导抗原特异性的CTL;共进行2次DC刺激,共计培养24 d,分别在培养前、培养第7天、第17天及第24天收获培养细胞,培养分为转染基因疫苗组和转染对照质粒组,流式细胞术分析培养细胞中CD3+ CD8+细胞亚群的水平;用针对基因疫苗抗原肽抗原表位的MHC五聚体荧光抗体检测CTL产生水平.结果 基因枪颗粒轰击方法转染DC后,RT-PCR结果显示转染得到了表达;转染基因疫苗组的DC中GM-CSF含量为(28±6)ng/106个细胞,而转染对照质粒组的DC中GM-CSF含量为(10±3)ng/106个细胞,差异有统计学意义(t=5.191,P<0.01).分析培养后的T淋巴细胞亚群,显示随着培养时间的延长,CD3+CD8+细胞亚群比例明显增加,转染对照质粒组在培养前、培养第7天、第17天和第24天的比例分别为(34.24±2.72)%,(46.06±3.08)%,(65.34±4.26)%,(73.86±4.85)%,而在转染基因疫苗组,其比例分别为(32.28±2.08)%,(45.32±3.81)%,(63.37±4.21)%,(75.01±3.20)%.两因素方差分析显示培养不同时间点的CD3+CD8+细胞亚群比例差异有统计学意义(F培养时间=176.966,P<0.01),但转染因素本身对其产生的影响差异无统计学意义(F转染因素=0.657,P>0.05).MHC五聚体检测结果显示转染基因疫苗组的DC能够诱导针对该表位的抗原特异性CTL产生,CTL水平随着DC的刺激逐渐增高;在培养第24天,健康对照者最高获得2.03%的CTL,滤泡性淋巴瘤患者的CTL达4.36%,而毛细胞白血病患者为3.89%.结论 MHC五聚体方法能够有效检测基因疫苗诱导的抗原特异性CTL;该方法对于抗肿瘤细胞免疫的检测、肿瘤患者的细胞免疫状态及早期预后判定可能是一项有前景的临床检验方法.

• 单位
  解放军总医院; 北京大学第一医院