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摘要
目的以活化转录因子4(ATF4)为靶点,探讨Krüppel样因子6(KLF6)调控紫外线B(UVB)诱导的晶状体上皮细胞(HLECs)凋亡的分子机制。方法 HLECs系(HLE-B3)进行常规培养,采用脂质体转染法将构建的真核表达质粒pEGFP-C2-ATF4转染HLECs作为UVB+ATF4转染组,并用能量密度为20 mJ/cm2的UVB照射细胞;未转染的ATF4细胞作为正常对照组。采用苏木精-伊红染色法和Hoechst染色法观察ATF4对HLECs细胞形态学的影响。将培养的细胞分为KLF6转染组及相应空质粒对照组,小干扰KLF6(siKLF6)组(转染pSilencer-KLF6质粒)及相应的空载体对照组(转染pSilencer空质粒),采用Western blot法检测细胞中ATF4蛋白的相对表达量。将培养的细胞分为4个组,联合空载体组HLECs联合转染pEGFP-C2空载体和pSilencer空载体;KLF6+pSilencer空质粒组HLECs联合转染pEGFP-C2-KLF6和pSilencer空载体;小干扰ATF4(siATF4)+pEGFP-C2组HLECs联合转染pEGFP-C2空载体和pSilencer-ATF4;KLF6+siATF4组HLECs联合转染pEGFP-C2-KLF6和pSilencer-ATF4,各组细胞均暴露于UVB 200 s,采用ELISA法检测上述各组HLECs凋亡值。结果正常对照组培养的HLECs大小均匀,排列整齐,细胞核呈卵圆形,数量多且完整;UVB照射后部分细胞核固缩,细胞间隙增大,少数细胞出现核分裂;UCB+ATF4转染组细胞数量减少,多数细胞出现核固缩和核分裂。UVB+ATF4转染组细胞中ATF4蛋白表达条带灰度明显强于UVB+空载体组,ATF4蛋白相对表达量分别为0.99±0.06和0.13±0.02,差异有统计学意义(t=23.13,P<0.01)。KLF6转染组细胞中KLF6和ATF4蛋白相对表达量均明显高于其空载体对照组,siKLF6组细胞中KLF6和ATF4蛋白相对表达量均明显低于其空载体对照组,差异均有统计学意义(均P<0.01)。ELISA检测显示ATF4转染组HLECs凋亡值为1.37±0.11,明显高于正常对照组的0.31±0.11,差异有统计学意义(t=8.034,P=0.001);KLF6+pSilencer空质粒组细胞凋亡值明显高于联合空载体组,siATF4+pEGFP-C2组细胞凋亡值明显低于联合空载体组,差异均有统计学意义(P<0.01,P=0.02);KLF6+siATF4组细胞凋亡率明显低于KLF6+pSilencer空质粒组,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 KLF6通过活化ATF4促进UVB诱导的HLECs凋亡,ATF4基因沉默可使细胞凋亡值明显降低,因此ATF4可作为KLF6调控HLECs凋亡的靶因子,也是KLF6调控LECs凋亡的主要生物机制之一。
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单位天津医科大学; 天津医科大学眼科医院
