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摘要
乙醛脱氢酶2（ALDH2） 是人体酒精代谢的关键酶类，主要存在于肝脏线粒体中。采用常规基因工程方法，以大肠杆菌为宿主细胞表达的重组ALDH2易形成无活性的包涵体。本研究拟通过将ALDH2与NusA标签融合表达，以获得能够在大肠杆菌中可溶性表达并且具有较好活性的重组蛋白。首先，根据ALDH2的基因序列设计引物，引入EcoRⅠ和XhoⅠ的酶切位点，PCR扩增出Aldh2基因片段，连接到pMD19-T-simple载体，并转化到大肠杆菌DH5α菌株。测序正确后，双酶切处理，将Aldh2基因片段克隆到表达载体pET44b（+）上NusA-tag下游的EcoRⅠ和XhoⅠ酶切位点之间，得到pET44b-NusA-ALDH2重组载体，转化入大肠杆菌BL21（DE3）菌株。经IPTG诱导，表达的融合蛋白具有良好的溶解性，主要存在于上清中。融合蛋白的最优表达条件为IPTG浓度0.25 mmol/L、诱导温度37 ℃、诱导时间3 h。重组蛋白的最适反应温度为37 ℃，在pH 8.0时达到最好的催化效果。不同的金属离子如Ca2+、K+、Na+、Mg2+、Mn2+都对酶有激活作用，且Mg2+效果最好，最佳的酶活性为1.64 U/mL。而野生型ALDH2在大肠杆菌中表达时完全以无活性的包涵体形式存在，复性后得到的酶活性为1.43 U/mL。本研究通过引入NusA进行融合表达，实现了ALDH2在大肠杆菌中的可溶性表达，且重组蛋白的活性优于包涵体复性蛋白。这些结果表明利用NusA进行融合表达是制备重组ALDH2的一个良好方法。
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单位浙江工商大学; 食品与生物工程学院
