miR-let-7c-3p靶向Egr-1调控白血病细胞定向单核/巨噬细胞分化的机制研究

作者：齐福; 王希娣; 王朝喆; 孙瑞婧; 都鹏超; 王静; 姜国胜^*

来源：中华肿瘤防治杂志, 2022, 29(08): 554-563.

DOI：10.16073/j.cnki.cjcpt.2022.08.05

• K562细胞
• 细胞分化
• miR-let-7c-3p
• 早期生长反应因子-1
• 巨噬细胞

目的 探讨miR-let-7c-3p/早期生长反应因子-1(Egr-1)信号轴在白血病细胞定向单核/巨噬细胞分化中的作用与分子机制。方法 人慢性髓系白血病K562细胞分别用100μg/L佛波酯(PMA,实验组)和0μg/L PMA(对照组)溶液向单核/巨噬细胞定向诱导分化48 h后，通过细胞形态学观察和流式细胞仪测定分化抗原，确定分化模型的成功建立；采用实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测白血病细胞分化前后Egr-1和miR-let-7c-3p的表达变化，蛋白质印迹法检测Egr-1蛋白表达变化；siRNA干扰实验检测Egr-1对细胞分化的影响，设PMA+si-Egr-1组和PMA+si-Ctrl组；双荧光素酶结合实验检测miR-let-7c-3p与Egr-1的3′UTR靶向结合和活性调控关系，用Egr-1-wt野生质粒、Egr-1-mut突变质粒和miR-let-7c-3p mimics或NC mimics共转染细胞，设置miR-let-7c-3p mimics+Egr-1-wt、miR-let-7c-3p mimics NC+Egr-1-wt、miR-let-7c-3p mimics+Egr-1-mut和miR-let-7c-3p mimics NC+Egr-1-mut组；通过细胞转染miR-let-7c-3p mimics和inhibitor调控miRNA表达，设置阴性对照序列(miR-let-7c-3p mimics NC和miR-let-7c-3p inhibitor NC),qRT-PCR验证调控效果；蛋白质印迹法检测miR-let-7c-3p对Egr-1的表达影响；流式细胞术检测miR-let-7c-3p对PMA诱导的K562细胞分化抗原的影响。结果 经过PMA体外诱导后，与对照组比较，实验组K562细胞增殖水平升高(0.85±0.03 vs 0.46±0.03;t=16.050,P<0.001),CD11b阳性表达量升高[(49.47±3.48)%vs(3.54±0.54)%;t=24.070,P=0.002],CD14阳性表达量也升高[(59.84±5.26)%vs(6.79±0.66)%;t=16.670,P=0.004]。与对照组比较，实验组Egr-1基因和蛋白表达水平升高，miR-let-7c-3p基因表达量降低，差异有统计学意义，均P<0.001。siRNA干扰实验结果显示，PMA+si-Egr-1组CD14分化抗原表达水平低于PMA+si-Ctrl组[(7.03±1.45)%vs(24.40±4.70)%;t=6.113,P=0.004]。双荧光素酶报告基因实验结果显示，miR-let-7c-3p mimics+Egr-1-wt组的荧光素酶活性低于miR-let-7c-3p mimics NC+Egr-1-wt组(0.77±0.006 vs 1.00±0.008;t=27.582,P<0.001)。蛋白质印迹法检测结果显示，K562细胞转染miR-let-7c-3p inhibitor后，Egr-1蛋白表达水平高于miR-let-7c-3p inhibitor NC组(0.83±0.12 vs 0.39±0.00;t=-6.416,P=0.003);转染miR-let-7c-3p mimics后，Egr-1蛋白表达水平低于miR-let-7c-3p mimics NC组(0.18±0.01 vs 0.48±0.06;t=8.421,P=0.001)。在miR-let-7c-3p对100μg/L PMA诱导K562细胞分化48 h的实验中，与0μg/L PMA组比较，100μg/L PMA可以诱导K562细胞分化抗原CD11b升高，分别为(3.44±0.43)%和(45.14±1.40)%,100μg/L PMA诱导K562细胞的同时转染miR-let-7c-3p inhibitor NC和miR-let-7c-3p inhibitor后，2组分化抗原CD11b分别为(43.91±1.00)%和(59.22±1.28)%,4组间CD11b表达水平差异有统计学意义，F=1 460.318,P<0.001。与0μg/L PMA组比较，100μg/L PMA同样诱导K562细胞的CD14表达升高，分别为(4.91±0.42)%和(70.54±1.45)%,100μg/L PMA共转染miR-let-7c-3p inhibitor NC或miR-let-7c-3p inhibitor后，CD14表达水平分别为(71.91±0.75)%和(85.98±0.52)%,4组间CD14表达水平差异有统计学意义，F=5 163.346,P<0.001。结论 miR-let-7c-3p可与Egr-1的3′UTR结合，并且可以靶向调控其表达水平变化。miR-let-7c-3p/Egr-1信号轴是白血病细胞定向分化为单核/巨噬细胞的重要途径之一。

• 单位
  济宁医学院; 基础医学院; 滨州医学院; 生命科学研究院