无PAM限制的CRISPR/Cas9系统构建及效率验证

作者：秦怀远; 李和刚; 张宁; 辛京京; 赵金山^*

来源：中国畜牧杂志, 2021, 57(04): 189-199.

DOI：10.19556/j.0258-7033.20200510-01

• CRISPR/Cas9
• 无PAM限制
• 突变体
• 基因编辑

CRISPR/Cas9系统在进行靶向基因敲除、转录激活以及抑制时,需要通过识别Cas9靶位点上的一个原间隔子相邻基序(PAM)序列进行特异性靶向基因编辑。现阶段,被广泛认可的化脓性链球菌SpCas9仅识别比较短的PAM为NGG(N为任意碱基,G为鸟嘌呤)。本实验在野生型SpCas9、PAM为NG的xCas9和SpCas9-NG的基础上,构建预期PAM为NNG的突变体SpCas9NNG、预期PAM为NNN的突变体xCas9NNN和ngCas9NNN,通过双荧光素酶报告基因检测评价其切割活性。结果显示:本次实验构建的ngCas9NNN突变体对PAM为NNN的靶标DNA具有显著的切割活性,为后续拓宽CRISPR/Cas9系统的靶向范围提供重要参考。

• 单位
  动物科技学院; 青岛农业大学