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摘要
目的建立小鼠内毒素血症模型,观察肿瘤坏死因子前体转换酶(TACE)前肽结构域对其催化结构域的自身抑制作用,为人工干预炎症过程提供依据和手段。方法首先利用DNA重组技术分别构建含前肽结构域和催化结构域的重组载体:用PCR方法扩增出TACE的胞外结构域(T1300)和前肽结构域(T591),并克隆至载体pET-28a(+)中,转化至大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达出带有His-tag的目的蛋白,两者均为包涵体,变性复活后经Ni2+-NTA亲和层析柱对表达的重组蛋白进行纯化。对纯化后的蛋白进行Western印迹分析。构建TACE信号肽+前肽结构域(T648)的真核表达质粒(pEGFP-N1/T648),将其瞬时转染HeLa细胞,通过观察绿色荧光蛋白的表达观察pEGFP-N1/T648转染后在细胞中分布情况。建立小鼠内毒素血症模型组,前肽重组蛋白治疗组和PBS对照组,通过流式细胞术检测小鼠腹腔巨噬细胞mTNF-α的表达,并取肝,肺,肾组织行HE染色,观察纯化的前肽蛋白对炎症的抑制作用。结果成功构建了pEGFP-N1/T648真核表达载体,在体外转染HeLa细胞,可见荧光主要分布在细胞膜上。流式细胞技术证明重组前肽蛋白可明显对抗LPS诱发的sTNF-α分泌增加,使小鼠腹腔巨噬细胞膜表面mTNF-α增加,常规病理切片HE染色显示该蛋白可降低LPS诱发的小鼠肝,肾,肺组织的炎症反应。结论TACE前肽重组蛋白降低了sTNF-α的分泌,对炎症有明显的抑制作用,为抗炎药物的设计和改造提供了新的依据和方法。
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单位武汉大学人民医院; 华中科技大学同济医学院附属同济医院; 生化与分子生物学系
