人类诺如病毒反向遗传体系的构建与验证

作者：陈水叶; 宋武慧^*; 易志刚^*

来源：微生物与感染, 2021, 16(02): 71-78.

• 人类诺如病毒
• T7启动子
• EF-1α启动子
• 感染性克隆
• 亚基因组克隆
• 临床病毒株

为验证已报道的能复制人类诺如病毒（human norovirus,HuNoV）GⅡ．3U201感染性克隆的复制能力，进一步在HuNoV临床病毒株中寻找更优序列，构建能高效复制的感染性克隆，本研究合成含有T7启动子和EF-1α启动子的HuNoV GⅡ．3U201全长序列，构建质粒pU201和pEF-1α-U201及对应的病毒RNA聚合酶失活的突变质粒。在COS 7细胞和Huh 7细胞中分别共转染T7聚合酶与pU201以及单独转染pEF-1α-U201，利用实时荧光定量聚合酶链反应检测转染后不同时间点细胞内病毒RNA水平。结果显示，与对照组相比，pU201和pEF-1α-U201的病毒RNA水平升高约2倍和3倍。为便于检测HuNoV复制，在pU201和pEF-1α-U201质粒中分别插入NanoLucTM荧光素酶报告基因，并命名为pU201-Nluc和pEF-1α-U201-Nluc。将质粒分别转染COS 7细胞和Huh 7细胞，检测转染后不同时间点Nluc荧光素酶活性。结果显示，pEF-1α-U201-Nluc的Nluc荧光素酶活性相较于对照组增高近2倍，而pU201-Nluc无明显升高，提示EF-1α启动子起始病毒复制优于T7启动子。为寻找优于HuNoV GⅡ．3U201的HuNoV序列，合成HuNoV GⅡ．4临床病毒株全长序列，将其插入EF-1α启动子载体中并转染细胞，于不同时间点检测上清及细胞中病毒RNA水平。结果显示，上清及细胞中病毒RNA水平与对照组相比无显著差异。以上结果提示，已报道可复制的HuNoV GⅡ．3U201反向遗传体系复制效率有限，且HuNoV反向遗传体系复制能力可能与不同序列的病毒相关。

• 单位
  上海市公共卫生临床中心; 复旦大学; 基础医学院