猪NMB基因过表达载体的构建及其在猪睾丸间质细胞中的表达

作者：王小雨; 何丹; 孙月; 於惠娴; 马卓; 于畅; 马志禹^*

来源：黑龙江畜牧兽医, 2022, (17): 74-142.

DOI：10.13881/j.cnki.hljxmsy.2021.09.0176

• 神经介素B(NMB)
• 慢病毒
• 过表达
• pCD513B-1
• 睾丸间质细胞
• 猪

为了构建猪神经介素B(pNMB)基因慢病毒过表达载体，以及研究其在猪睾丸间质细胞中稳定表达情况，试验采用RT-PCR方法扩增获得pNMB基因的CDS序列，插入到pMD-19T载体中，构建pMD19-T-pNMB重组质粒，对该重组质粒和慢病毒过表达质粒pCD513B-1进行双酶切，以获得的线性化pCD513B-1和线性化pNMB质粒构建pCD513B-1-pNMB重组慢病毒过表达载体；将重组慢病毒过表达载体pCD513B-1-pNMB和辅助质粒(pGag/Pol、pRev和pVSV-G)共转染至HEK293T细胞中，包装获得pNMB过表达慢病毒，并用倍比稀释法测定病毒含量；用pNMB过表达慢病毒转染猪睾丸间质细胞，通过嘌呤霉素抗性筛选获得稳定表达的细胞，利用实时荧光定量PCR方法检测pNMB mRNA的表达情况。结果表明：RT-PCR扩增获得大小约为366 bp的目的片段，与GenBank中pNMB基因的CDS序列完全一致，RT-PCR扩增片段与目的片段序列完全相同；将pNMB基因克隆到pMD-19T载体中，成功构建出pMD19-T-pNMB重组质粒；XbaⅠ和EcoRⅠ双酶切重组质粒pMD19-T-pNMB和慢病毒过表达载体pCD513B-1后获得线性化pCD513B-1和线性化pNMB,并成功构建了重组慢病毒过表达载体pCD513B-1-pNMB;包装获得了pNMB过表达慢病毒，病毒含量约为5×106 TU/mL;pNMB过表达慢病毒成功转染了猪睾丸间质细胞，筛选获得pNMB mRNA稳定高表达的细胞。说明构建的pNMB过表达慢病毒可用于研究过表达pNMB基因对猪睾丸间质细胞的影响。

• 单位
  江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心; 扬州大学